巨噬細胞精選(九篇)

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第1篇：巨噬細胞范文

細胞感染模型制作參照預(yù)實驗結(jié)果，按感染復數(shù)（multiplicityofinfection，MOI）為50∶1（細菌∶細胞）將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的ST6、ST6－ΔpRST98、ST6－c－pRST98加入細胞，100g離心10min，繼續(xù)在5％CO2、37℃條件下共培養(yǎng)1h。棄上清液（此時定為0點），加入含100mg／L的AMK培養(yǎng)液作用2h，以殺死胞外菌，在0h和2h收集細胞進行檢測。1．2．5自噬蛋白LC3和p62的檢測分別在0h和2h收集細胞，用于檢測自噬相關(guān)蛋白LC3和p62。用預(yù)冷的磷酸緩沖液（phosphatebufferedsaline，PBS）洗1次，100g離心5min，小心吸除上清液。在細胞中加入裂解液，超聲裂解細胞，4℃13200g離心20min，吸取上清液后用二羧基二喹啉酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度。取60μg樣品上樣，進行10％十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulfate－polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS－PAGE）（濃縮膠70V，30min；分離膠90V，70min），將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（300mA，70min），5％脫脂奶粉室溫封閉1h；加入鼠抗β－actin（1∶3000稀釋）、兔抗LC3（1∶1000稀釋）和兔抗p62（1∶1000稀釋），4℃孵育過夜。次日室溫孵育1h，用含Tween20的Tris緩沖液（Trisbuff－eredsalineandTween20，TBST）洗3次，每次5min；加入鼠二抗（1∶3000稀釋）、兔二抗（1∶3000稀釋），室溫孵育90min，TBST洗3次，每次5min；化學發(fā)光法顯影，檢測LC3和p62蛋白的表達。mRFP－GFP－LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡觀察自噬體和自噬溶酶體變化應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將與單體紅色／綠色熒光蛋白（monomericredfluo－rescentprotein－greenfluorescentprotein，mRFP－GFP）偶聯(lián)的自噬蛋白LC3真核細胞表達載體mRFP－GFP－LC3質(zhì)粒導入巨噬細胞。取對數(shù)生長期的THP－1細胞，接種于鋪有小圓玻片的24孔板，2×105個／孔，PMA誘導分化成熟。轉(zhuǎn)染時，細胞融合度為80％～90％。棄去孔內(nèi)含10％胎牛血清的RPMI1640，用無血清RPMI1640洗2次，每孔加500μl無血清RPMI1640，37℃、5％CO2培養(yǎng)1h。用50μl無血清RPMI1640稀釋0．8μg質(zhì)粒DNA，輕輕吹吸3～5次混勻。用50μl無血清RPMI1640稀釋2μlLipofectamineTM2000，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫靜置5min。混合轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA稀釋液，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫靜置30min。將轉(zhuǎn)染復合物緩慢滴加至24孔板中，100μl／孔，前后輕搖細胞板混勻。1．3統(tǒng)計學處理用SPSS17．0進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)處理，多個實驗組均數(shù)間兩兩比較采用LSD－t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

CQ阻斷THP－1細胞自噬的濃度確定用WB和MTT法確定CQ工作濃度。p62作為自噬的底物蛋白，主要在自噬溶酶體中降解。CQ可通過破壞溶酶體中酸性水解酶的活性，使p62無法正常降解而累積。WB結(jié)果顯示，30μmol／LCQ作用細胞6h后，p62已明顯累積；40μmol／LCQ作用細胞6h后，累積程度達飽和（圖1A、1B）。結(jié)合MTT法檢測CQ對細胞活性的影響，30μmol／LCQ作用24h后，細胞存活率為58．58％；而40μmol／LCQ作用24h后，細胞存活率僅為46．03％（圖1C）。細菌OD值測定結(jié)果表明，30μmol／LCQ對ST6、ST6－ΔpRST98和ST6－c－pRST98菌量無明顯影響，因此將30μmol／L作為CQ的工作濃度。傷寒沙門菌質(zhì)粒對THP－1自噬蛋白LC3Ⅱ與p62表達的影響WB結(jié)果顯示，細菌與THP－1作用0h，CQ處理組LC3Ⅱ／β－actin值及p62／β－actin值明顯高于對照組，其中突變株ST6－ΔpRST98LC3Ⅱ／β－actin值及p62／β－actin值的增加量均高于野生株ST6（圖2A、2B、2D）。細菌與THP－1作用2h，CQ處理組LC3Ⅱ／β－actin值及p62／β－actin值較對照組明顯上升，但突變株ST6－ΔpRST98的上升量仍顯著高于野生株ST6（圖2A、2C、2E）。mRFP－GFP－LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡觀察自噬體和自噬溶酶體的變化轉(zhuǎn)染mRFP－GFP－LC3質(zhì)粒的細胞，自噬體為紅綠疊加后形成的黃色點狀聚集物，因溶酶體的酸性環(huán)境會淬滅綠色熒光而對紅色熒光無影響，使自噬溶酶體表現(xiàn)為紅色點狀聚集物。若自噬活性上升，可觀察到黃色自噬體和紅色自噬溶酶體的點狀聚集物均增多；若自噬體與溶酶體的融合被阻斷、自噬溶酶體的生成減少，僅表現(xiàn)為黃色自噬體點狀聚集物增多。結(jié)果顯示，0hCQ干預(yù)組突變株ST6－ΔpRST98感染細胞的點狀聚集物數(shù)量高于對照組，而野生株ST6和回補株ST6－c－pRST98感染細胞的點狀聚集物數(shù)量無差異。2hCQ干預(yù)組3株菌感染細胞的點狀聚集物數(shù)量均高于對照組，其中突變株ST6－ΔpRST98上升量顯著高于野生株ST6及回補株ST6－c－pRST98（圖3）。

自噬是不同于凋亡的一種細胞死亡方式，自1962年提出后已成為當前研究熱點。自噬主要是通過細胞內(nèi)的雙層膜結(jié)構(gòu)包裹需降解的細胞器、蛋白質(zhì)或外來異物形成自噬體，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，在自噬體內(nèi)利用溶酶體水解酶降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)和細胞器的更新［8］。在細胞自噬與感染性疾病關(guān)系的研究中，自噬被視為機體對抗病原體入侵的一種方式，不僅可通過自噬溶酶體途徑清除細菌發(fā)揮天然免疫應(yīng)答效應(yīng)，還參與病原菌的抗原呈遞過程，對細胞的生存起至關(guān)重要的保護作用［9，10］。目前，在酵母和其他真核生物中已發(fā)現(xiàn)許多自噬相關(guān)基因（autophagy－relatedgene，ATG），其中微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule－associatedprotein1lightchain3，MAP1－LC3）是酵母Atg8在哺乳動物細胞中的同源物。在自噬過程中，LC3Ⅰ經(jīng)類泛素化酶催化其C端并與磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）偶聯(lián)后轉(zhuǎn)變?yōu)長C3Ⅱ［8］。一旦自噬體與溶酶體融合，自噬體內(nèi)的LC3Ⅱ即被溶酶體中的水解酶降解。LC3Ⅱ是目前發(fā)現(xiàn)的唯一定位于自噬體膜上的自噬相關(guān)蛋白，其含量多少與自噬泡數(shù)量成正比［11］。因此，WB檢測細胞內(nèi)LC3Ⅱ含量變化或激光共聚焦法檢測細胞質(zhì)內(nèi)LC3點狀結(jié)構(gòu)，即可實現(xiàn)對自噬體形成的檢測［12］。p62能結(jié)合泛素化的蛋白與LC3偶聯(lián)，參與自噬體形成［13］。自噬發(fā)生時，隨著蛋白質(zhì)不斷降解，p62水平逐漸降低；而在自噬缺陷細胞中，可觀察到p62累積［14，15］。因此，p62也被作為檢測自噬活性的一個標記蛋白，其表達水平與自噬活性呈負相關(guān)。CQ作為一種自噬阻斷劑，通過提高溶酶體中的pH值，使溶酶體中的酸性水解酶失活，導致自噬溶酶體無法分解底物［16］，造成位于自噬體和自噬溶酶體膜上的LC3Ⅱ和p62不能及時降解，致使蛋白累積。

第2篇：巨噬細胞范文

目的：建立用流式細胞術(shù)檢測小鼠腹腔誘導的巨噬細胞吞噬功能的方法。方法：用貼壁法篩選有活性的巨噬細胞，再與用碳酸鹽緩沖液制備的熒光素(FITC)標記的大腸埃希菌混合，37℃孵育，每10min取少量固定后加EB染巨噬細胞核，用流式細胞儀檢測，計算巨噬細胞對大腸埃希菌的吞噬率。結(jié)果：FITC能夠有效標記大腸埃希菌；小鼠腹腔誘導的巨噬細胞能夠吞噬大腸埃希菌，并且在30min時達到最大峰值。結(jié)論：用流式細胞術(shù)檢測小鼠巨噬細胞吞噬FITC標記大腸埃希菌是測定巨噬細胞吞噬功能簡便、快速和重復性好的定量方法。

【關(guān)鍵詞】 巨噬細胞 吞噬作用 大腸埃希菌 流式細胞儀

Establish a New Method of Detecting Phagocytosis of Macrophage by Flow Cytometry

Abstract Objective: To use a new method of detecting phagocytosis of macrophage induced from the Belly of mouse by flow cytometry. Methods: Firstly， the living macrophages were collect by cultivating and adherencing， and bacterium coli(E. coli) was labeled FITC. Secondly， E. coli was mixed with macrophages， every 10 minute to take out of small amounts of mixed liquor，and add a little of EB dye. Finally， the fluorescent intensity was measured by flow cytometry. Results: The E. coli was labeled well by FITC in carbonate buffer. Macrophage can phagocytize E. coli and the efficient rat of phagocytosis was highest about at 30 minute. Conclusion: The method that detecting phagocytosis of macrophage phagocytizs E. coli is convenient、fast、good repeatability.

Key words macrophage; phagocytosis; bacterium coli; flow cytometry

巨噬細胞(macrophage，MP)是機體天然免疫的主要免疫細胞，吞噬率則直接反映巨噬細胞的吞噬功能。通常測定吞噬率的方法是對吞噬細菌的MP染色后在顯微鏡下觀察、計數(shù)的方法，也有研究者用流式細胞儀(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)檢測MP的吞噬功能［1，2］。我們在檢測小鼠MP吞噬細菌的實驗中發(fā)現(xiàn)，小鼠MP的形態(tài)較小，染色后在顯微鏡下觀察計算吞噬率較為困難。本研究試建立用流式細胞術(shù)FITCEB法檢測MP的吞噬功能，以求找到一種簡便、客觀和重復性好的方法。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑

FITC；EB；2%淀粉肉湯；大腸埃希菌DH5A；2%瓊脂LB固體培養(yǎng)基；含血清培養(yǎng)基；流式細胞儀四色校準微球(CaliBRITEBeads，美國BD公司)。

1.1.2 實驗動物

BALB/C小鼠，25只，體重(19±2)g，由本院免疫學教研室保存提供。

1.1.3 主要儀器和軟件

隔水恒溫培養(yǎng)箱，型號：GNP9270 (上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；自控式CO2細胞孵育箱，型號：2300（美國Shellab公司）；分光光度計，型號：Jenway 6305 (Barloworld公司)；蔡司熒光顯微鏡，型號：ZEISS AXIO Imager.A1 (蔡司光學儀器（上海）國際貿(mào)易有限公司)；流式細胞儀，型號：FACSCalibur (美國BD公司)；CellQuest軟件。

1.2 實驗方法

1.2.1 大腸桿菌培養(yǎng)及標記熒光素(FITC)

接種大腸桿菌于2%瓊脂LB固體培養(yǎng)基表面皿上，在37℃隔水恒溫培養(yǎng)箱中孵育48h，取少量菌落用PBS洗，革蘭氏（圖1）和GW染色觀察（圖3），并調(diào)節(jié)濃度(OD≈0.40在620nm處）。熒光素標記大腸桿菌［3］：離心去上清，加入250ul 1%Triton X100 和1ml FITC（0.01mg FITC/500ul 碳酸鹽緩沖液）37℃避光孵育15min，離心去上清，少量PBS重懸細菌待用，并用熒光顯微鏡觀察（圖2）。

1.2.2 巨噬細胞吞噬大腸桿菌

誘導、篩選腹腔巨噬細胞：腹股溝注入1ml2%淀粉肉湯液，48h后開腹腔收集滲出液，培養(yǎng)基洗一次，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中37℃ CO2孵育箱孵育2h，收集貼壁細胞（1×107event）于離心管中4ml培養(yǎng)基重懸待用，并GW染色觀察（圖3）。檢測巨噬細胞吞噬大腸桿菌：加FITC標記大腸桿菌于巨噬細胞培養(yǎng)液中，置于37℃水平搖床上（慢速搖動），每10min取搖勻液0.5ml，PBS洗一次，70%乙醇固定10min，離心后加入1ml EB(0.5μg/ml)，37℃避光孵育15min待測。首先使用BD CaliBRITE Beads試劑調(diào)整儀器，設(shè)定儀器基本參數(shù)，上樣后先用FSCH/SSCH圈定MP，再采集紅色熒光強度，并計算實際吞噬率（某時刻實際吞噬率=某時刻吞噬率-0min時的吞噬率），同時取少量GW染色觀察（圖3）。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠巨噬細胞吞噬FITC標記大腸埃希菌的定量觀察

由大腸埃希菌的革蘭氏染色圖像（圖1）可以看出：大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌，并沒有其他細菌污染，可以應(yīng)用于吞噬實驗；由大腸埃希菌的熒光顯微鏡觀察（圖2）可以看出：用碳酸鹽緩沖液(pH=9) 制備的熒光素(FITC)能夠有效標記大腸埃希菌；在不同時間段GW染色觀察巨噬細胞吞噬大腸埃希菌過程的圖像（圖3）中可以看出：在0～20min內(nèi)巨噬細胞吞噬大腸埃希菌的量逐漸增加（巨噬細胞吞噬泡中大腸埃希菌的量增加），30min左右時巨噬細胞吞噬量最高，40min后巨噬細胞吞噬量有減少趨勢（吞噬泡中有明顯的溶菌現(xiàn)象，泡內(nèi)大腸桿菌形態(tài)逐漸模糊）。

2.2 小鼠巨噬細胞吞噬FITC標記大腸埃希菌的動力學特點

小鼠巨噬細胞與FITC標記大腸埃希菌在37℃作用不同時間后， 巨噬細胞的實際吞噬率在0、10、20、30、40、50min時分別為0%、11.20±2.0%、21.57±2.1%、62.22±5.0%、54.58±3.5%、37.22±4.1%，在30min左右即達到峰值（表1，圖4）。表1 巨噬細胞吞噬大腸埃希菌的動力學數(shù)據(jù)(略)

3 討論

人類細胞免疫功能一般認為應(yīng)包括白細胞、紅細胞及巨噬細胞等三大系統(tǒng)，其相應(yīng)的檢測指標分別為：以CD4和CD8為主的T細胞亞群檢測，以RBCC3bRR和RBCICR為主的紅細胞免疫功能檢測和以巨噬細胞吞噬率為主的巨噬細胞吞噬功能檢測。但是，在臨床上由于細胞免疫功能檢測方法較繁瑣，往往作前兩項檢測，對于某些免疫性疾病以及與免疫功能損傷有關(guān)疾病的診斷與治療中，全面地評估機體的免疫狀態(tài)極為重要。

檢測MP功能最常用的方法之一就是檢測其對細菌的吞噬率，傳統(tǒng)方法是取外周血與細菌混合作用后涂片染色，在顯微鏡下觀察MP對細菌的吞噬率。該方法一般要尋找200個以上MP中吞噬細菌MP數(shù)量，操作較煩瑣，且形態(tài)較小，顯微鏡下觀察其對細菌的吞噬率更為困難。因此，已有研究者報道用流式細胞術(shù)測定中性粒細胞對熒光素標記細菌的吞噬功能［4，5］，但目前有關(guān)巨噬細胞吞噬功能的檢測報道不多。

本研究在前人研究基礎(chǔ)上［6］，選擇FITC和EB雙熒光性物質(zhì)標記法檢測MP對大腸埃希菌的吞噬功能。其檢測原理是：首先利用FITC在碳酸鹽緩沖液中標記大腸埃希菌，再用MP吞噬標記后的大腸埃希菌，吞噬完成后，加入EB染料標記MP，在488nm的激光下MP內(nèi)大腸埃希菌上的FITC首先發(fā)出綠色熒光，其熒光又可以激發(fā)MP上的EB染料，使其產(chǎn)生紅色熒光，通過計算紅色熒光的表達率反映MP對大腸埃希菌的吞噬功能。實驗結(jié)果顯示：0～20min內(nèi)吞噬率逐漸增加；30min左右吞噬率達到平臺，與有關(guān)資料一致；40min以后吞噬率反而減少，有可能通過MP內(nèi)溶菌酶作用把MP內(nèi)細菌消化、分解，釋放到細胞外，導致MP內(nèi)細菌減少，熒光能力減弱。其中，在流式細胞儀熒光強度直方圖中CV平均值為3.9%，由此可見，自動流式細胞儀用于檢測巨噬細胞吞噬功能，不但測量數(shù)據(jù)準確性高、重復性好、操作簡便、快速，而且保持MP細胞膜的完整性，能夠直接體現(xiàn)MP對細菌的吞噬能力，同時彌補了FITC熒光性弱難以區(qū)分、檢測的弱點。

本實驗結(jié)果充分證明通過流式細胞術(shù)的FITCEB法能夠簡便、快速和重復性好地定量檢測巨噬細胞對大腸埃希菌的吞噬功能。

參考文獻

1 張盈華，殷纓，張莉，等.流式細胞儀測定巨噬細胞吞噬率方法的建立及其應(yīng)用.第四軍醫(yī)大學學報.2002，23(17):1559～1561.

2 WhiteOwen C，Alexander JW，Sramkoski RM，et al.Rapid whole blood microassay using flow cytometry for measuring neutrophil phagocytosis. J Clin Microbiol， 1992，30(8):2071～2076.

3 趙修春，姚春艷，李柏青，等.流式細胞術(shù)檢測小鼠中性粒細胞吞噬功能的方法學探討.基礎(chǔ)醫(yī)學.2004，29(5):388～390.

4 Vander Top EA， Perry GA， GentryNielsen MJ. A novel flow cytometric assay for measurement of in vivo pulmonary neutrophil phagocytosis. BMC Microbiology. 2006，6:61.

第3篇：巨噬細胞范文

    【關(guān)鍵詞】  辛伐他汀; 巨噬細胞; 基質(zhì)金屬蛋白酶-9; 金屬蛋白酶組織抑制因子-1

    Abstract:【Objective】 To investigate the effects of simvastatin drug-serum on the expression and secretion of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in U937 monocyte-derived macrophages. 【Methods】 Fifteen New Zealand rabbits were randomized to 3 groups, normal control group (NL, n=5), atherosclerotic model group (AS, n=5) and simvastatin drug-serum group (SIM, n =5). The rabbit atherosclerotic model was developed by high cholesterol feeding. Then they were medicated with simvastatin liquor by gavage to prepare simvastatin drug-serum. U937 monocyte-derived macrophages were incubated with different concentrations (5%, 10%, and 20%) of simvastatin drug-serum for 24 hours. The mRNA expression and protein secretion of MMP-9 and TIMP-1 were detected by RT-PCR and ELISA. 【Results】 Compared to same concentration AS group, 5%, 10%, and 20% SIM group significantly inhibited the expression of MMP-9 mRNA in U937 monocyte-derived macrophages (P=0.005, 0.041, and 0.013), and the expression difference of TIMP-1 mRNA were not significant (all P >0.05). Compared to same concentration AS group, 10% and 20% SIM group not only significantly inhibited the secretion of MMP-9 in U937 monocyte-derived macrophages (P=0.009 and 0.001), but also significantly increased the secretion of TIMP-1 ( P = 0.017 and 0.001) . 【Conclusion】 Simvastatin inhibits the expression and secretion of MMP-9 and enhances the secretion of TIMP-1.

    Key words: simvastatin; macrophage; matrix metalloproteinase-9; tissue inhibitor of metalloproteinase-1

    冠狀動脈粥樣硬化斑塊由穩(wěn)定轉(zhuǎn)為不穩(wěn)定,繼而破裂導致血栓形成是急性冠脈綜合征最主要的發(fā)病機制[1, 2]。斑塊脂質(zhì)核心大、纖維帽薄、巨噬細胞多是結(jié)構(gòu)性易損斑塊[3]。斑塊內(nèi)單核巨噬細胞聚集,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)增多,金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP)減少,導致斑塊內(nèi)膠原降解,纖維帽變薄,是斑塊穩(wěn)定性下降的重要原因[4, 5]。臨床研究顯示他汀對急性冠脈綜合征治療有效,可能與改善內(nèi)皮功能、抗炎及穩(wěn)定斑塊等調(diào)脂以外的作用有關(guān)[6],但其具體機制尚未完全明確。本研究擬觀察辛伐他汀含藥血清對U937單核細胞源巨噬細胞MMP-9及TIMP-1表達與分泌的影響,以探討辛伐他汀穩(wěn)定斑塊、治療急性冠脈綜合征的機制。

    1   材料與方法

    1.1   材料準備

    雄性純種新西蘭大白兔,體質(zhì)量2.0~2.5 kg,購自中山大學動物實驗中心。人單核白血病細胞株U937細胞,購自中山大學動物實驗中心細胞庫。辛伐他汀藥片,購自默沙東公司,實驗時溶解于蒸餾水灌胃。

    RPMI 1640培養(yǎng)基,購自Gibco公司。新生牛血清,購自PAA公司。佛波酯(PMA),購自Sigma公司。Trizol reagent,購自Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,購自Fermentas公司。Taq酶購自Takara公司。PCR反應(yīng)引物,由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。人MMP-9、TIMP-1細胞上清ELISA試劑盒,購自RapidBio公司。

    1.2   動脈粥樣硬化模型建立及含藥血清制備

    15只新西蘭大白兔隨機分為3組:正常對照組(normal, NL)、粥樣硬化模型組(atherosclerosis group, AS)和辛伐他汀含藥血清組(simvastatin group, SIM),每組5只。正常對照組予普通飼料喂養(yǎng)12周,其余各組予高脂飼料(1%膽固醇、10%豬油、89%普通飼料)喂養(yǎng)10周后,每組隨機處死1只,證實有大動脈粥樣硬化形成后,繼續(xù)高脂喂養(yǎng)至12周,其中SIM組于第11周起給予辛伐他汀5 mg/kg,每天1次,灌胃14 d。末次給藥前禁食12 h,給藥后1 h頸動脈無菌取血,分離血清,同組動物血清混勻,0.22 ?滋m濾膜過濾滅菌,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3   細胞培養(yǎng)及干預(yù)

    U937細胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于含5% CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中,待細胞生長至接近融合時傳代,2~3代后用于實驗。調(diào)整細胞密度為5×106/mL,接種于6孔培養(yǎng)板,加入PMA使終濃度為50 ng/mL,培養(yǎng)48 h后見懸浮生長的U937細胞分化為巨噬細胞,伸出偽足,貼壁生長。棄去舊培養(yǎng)基,PBS液洗滌后,予不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,棄去培養(yǎng)基。分別加入各含5%、10%、20%正常兔血清,5%、10%、20%粥樣硬化兔血清,以及5%、10%、20%辛伐他汀含藥血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,每組設(shè)3個平行組,培養(yǎng)24 h用于RT-PCR實驗。

    1.4   總RNA提取

    吸凈培養(yǎng)基,每孔加入1 mL的Trizol液,吹打裂解細胞,收集于無RNA酶離心管中,室溫靜置5 min。加入0.2 mL氯仿,劇烈顛倒15 s,室溫靜置3 min,4 ℃,12 000 × g離心10 min。轉(zhuǎn)移上層水相液500 ?滋L到新的離心管,加入500 ?滋L異丙醇,室溫靜置10 min,4 ℃,12 000 × g離心7 min。棄上清,加入1 mL無RNA酶水配制的75%酒精,振蕩混勻,4 ℃,7 500 × g離心5 min。重復酒精洗滌沉淀一遍,棄去酒精,室溫干燥5 min,融解RNA于30 ?滋L無RNA酶水中,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性,紫外分光光度計測定RNA含量,計算出RT-PCR所需樣品量。

    1.5   RT-PCR

    取總RNA1.5 ?滋g,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以β-actin為內(nèi)參照,進行半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)。聚合酶鏈式反應(yīng):95 ℃ 5 min預(yù)變性,94 ℃ 45 s變性,56 ℃ 30 s退火,72 ℃ 45 s延伸,共35個循環(huán),最后一次循環(huán)在72 ℃延伸7 min。RT-PCR產(chǎn)物用含1.5%瓊脂糖凝膠電泳,Labwork成像系統(tǒng)采集圖像及分析。合成引物序列,MMP-9-上游引物:5′- AGGACGGCA ATGCTGAT-3′,下游引物:5′- CGCCACGA GGAACAAACT-3′,擴增產(chǎn)物為362 bp;TIMP-1-上游引物:5′- TTCCGACCTCGTCATCAG-3′,下游引物:5′- GCATTCCTCACAGCCAAC-3′,擴增產(chǎn)物為340 bp;β-actin-上游引物:5′- ATCGTGCGTGA CATTAAGG-3′,下游引物:5′-ACAGGACTCC ATGCCCAGG-3′,擴增產(chǎn)物為195 bp。

    1.6   ELISA測定

    收集細胞上清液,4 ℃,3 000 r/min離心10 min,取上清,-80 ℃保存待檢。ELISA采用雙抗體夾心法,按照說明書步驟進行,測定細胞上清MMP-9、TIMP-1濃度。

    1.7   統(tǒng)計學處理

    所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(x±s)表示,三組間比較用單因素方差分析,兩組間比較用LSD-t 檢驗,應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析,P< 0.05 為差異有顯著性。

    2   結(jié)   果

    2.1   辛伐他汀含藥血清對U937單核源巨噬細胞MMP-9 mRNA表達的影響

    與相同濃度NL組相比,5%、10%、20%AS組MMP-9 mRNA表達均顯著性增高(P值均< 0.05)。與相同濃度AS組相比,5%、10%、20%SIM組MMP-9 mRNA表達均顯著性降低(P值分別為0.005、0.041和0.013)。與相同濃度NL組相比,5%、10%SIM組MMP-9 mRNA表達均增高(P值分別為0.034和0.029,表1、圖1)。

    不同濃度間SIM組MMP-9 mRNA表達差別無統(tǒng)計學意義(F=1.747,P=0.252)。

    2.2   辛伐他汀含藥血清對U937單核源巨噬細胞TIMP-1 mRNA表達的影響

    NL組、AS組和SIM組不同濃度之間TIMP-1 mRNA表達無顯著差異(表2、圖2)。5%、10%和20%SIM組之間TIMP-1 mRNA的表達有顯著性差異(F= 6.498,P=0.032)。與5%SIM組相比,10%、20%SIM組TIMP-1 mRNA的表達顯著性增加(P=0.039、0.014),而10%與20%SIM組之間無顯著性差異(P=0.446)。

    2.3   辛伐他汀含藥血清對U937單核源巨噬細胞MMP-9蛋白分泌的影響

    與同濃度NL組比較,10%、20%AS組MMP-9分泌均顯著性增加(P=0.007、0.002);5%、10%、20%SIM組MMP-9分泌無顯著性差異(P=0.824、0.857、0.658)。與同濃度AS組比較,5%SIM組MMP-9分泌無顯著性差異(P=0.427),10%、20%SIM組MMP-9分泌顯著性減少(P=0.009、0.001,表3)。

    SIM組不同濃度之間MMP-9分泌無顯著性差異(F=0.985,P=0.427)。

    2.4   辛伐他汀含藥血清對U937單核源巨噬細胞TIMP-1蛋白分泌的影響

    與同濃度NL組比較,AS組TIMP-1分泌均顯著性減少(P=0.004、0.044、0.003);與同濃度NL組比較,5%SIM組TIMP-1分泌減少(P=0.038)。與同濃度AS組比較,10%、20%SIM組TIMP-1分泌均顯著性增加(P=0.017、0.001,表4)。

    SIM組不同濃度之間TIMP-1分泌有顯著性差異(F=6.555,P=0.031)。與5%SIM組相比,10%、20%SIM組 TIMP-1分泌均顯著性增加(P=0.038和0.014)。而10%和20%含藥血清之間差異無顯著性(P=0.456)。

    3   討   論

    3. 1   MMP/TIMP與動脈粥樣斑塊穩(wěn)定性

    急性冠狀動脈綜合征患者是易損病人[1],通常指在冠狀動脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上,斑塊破裂,繼而血小板粘附聚集和血栓形成,引起完全或不完全的血管阻塞,導致不穩(wěn)定型心絞痛、非ST段抬高心肌梗死、ST段抬高心肌梗死及猝死。有報道[7-9]冠脈“罪犯”病變處多是軟斑塊、以正性重構(gòu)為主,常伴血栓形成。斑塊內(nèi)細胞外基質(zhì)過度降解,導致斑塊中膠原含量減少,纖維帽變薄,是影響斑塊穩(wěn)定的重要因素。斑塊破裂常發(fā)生在富含單核巨噬細胞的斑塊肩部,此處巨噬細胞可分泌大量MMP,促進纖維帽降解[10]。MMP-9,又稱明膠酶B,是巨噬細胞分泌的主要基質(zhì)金屬蛋白酶。TIMP是MMP的抑制物,目前已發(fā)現(xiàn)有4種:TIMP-1~TIMP-4,它們均可與激活的MMP 呈1 ∶ 1結(jié)合,從而使MMP失活。用免疫組化方法檢測動脈粥樣硬化斑塊顯示TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3顯著性增多,且多存在于斑塊肩部的巨噬細胞、纖維帽和脂核內(nèi),與MMP分布部位一致,部分抑制MMP的活性[11]。急性冠脈綜合征患者存在著由炎癥反應(yīng)導致的以MMP-9升高為主的MMP-9/ TIMP-1失衡狀態(tài)[2]。因此MMP與TIMP之間的平衡,對斑塊穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)具有重要意義。研究還表明[12],MMP-9在轉(zhuǎn)錄水平上受多種細胞因子、生長因子及活性物質(zhì)的調(diào)節(jié),而TIMP的表達很少受細胞因子和生長因子的影響。本實驗采用血清藥理學方法觀察到,與同濃度NL組相比較,5%、10%和20%AS組U937單核源巨噬細胞MMP-9表達均顯著性增高(P值均< 0.05)。這可能是因為粥樣硬化血清中含有較高的低密度脂蛋白膽固醇,以及大量激活的炎性細胞因子、生長因子以及其他活性物質(zhì),促進MMP -9的表達。與相同濃度NL組比較,AS組TIMP-1 mRNA表達無顯著性差異,但TIMP-1的分泌均顯著性減少(P< 0.05),提示動脈粥樣硬化血清不但可使巨噬細胞MMP-9增加,同時還可使TIMP-1分泌增加(翻譯后水平)而表達(mRNA水平)并未增加,具體機制尚不清楚。

    3. 2   他汀藥與MMP/TIMP

    PROVE IT(TIMI-22)研究[13]顯示強化他汀治療可使ACS患者30 d的臨件減少,在穩(wěn)定的患者,使臨件長期降低,但其具體機制尚未完全明確。Luan等[14]報道,西立伐他汀呈劑量依賴性抑制兔平滑肌細胞和巨噬細胞MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9,但對TIMP-1和TIMP-2無影響。本研究顯示,與相同濃度AS組相比,5%、10%和20%SIM組MMP-9 mRNA表達均顯著性降低(P值< 0.05);10%、20%SIM組MMP-9蛋白的分泌顯著性減少(P值均< 0.01)。與相同濃度AS組相比,SIM組TIMP-1 mRNA表達無顯著性差異(P >0.05);但10%、20%SIM組TIMP-1分泌均顯著性增加(P值均< 0.01)。與Luan等[14]的報道有所不同,本研究顯示辛伐他汀不但在一定劑量范圍內(nèi)可抑制巨噬細胞MMP-9的轉(zhuǎn)錄與分泌,而且增加TIMP-1的分泌。這可能是辛伐他汀穩(wěn)定斑塊、減少臨件的機制之一。他汀具有多效作用(Pleiotropic effects)[15],除了調(diào)脂作用外,還有抗炎、改善內(nèi)皮功能等作用。辛伐他汀可能通過抑制巨噬細胞MMP-9的轉(zhuǎn)錄與分泌,同時還增加TIMP-1的分泌,從而調(diào)節(jié)MMP與TIMP之間的平衡,起到穩(wěn)定斑塊的作用。

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第4篇：巨噬細胞范文

[關(guān)鍵詞] 重組人粒巨噬細胞刺激因子；腫瘤化療；白細胞減少癥；血小板減少癥

[中圖分類號] R577+.1 [文獻標識碼]C[文章編號]1674-4721（2011）07（b）-191-02

化療是惡性腫瘤綜合治療的主要手段之一，但化療往往會引起很多毒副反應(yīng)、并發(fā)癥及后遺癥，其中最常見的毒副反應(yīng)是骨髓抑制，由于紅細胞壽命較長，受影響相對較小，因而對白細胞和血小板的影響表現(xiàn)顯著，而當白細胞減少或者血小板減少時，不得不推遲化療時間或者減少化療藥物劑量，以致中斷治療，影響療效，長時間粒細胞缺乏易并發(fā)感染，嚴重者可導致患者死亡，而血小板的減少則可能導致出血性疾病的發(fā)生。為了防止化療后白細胞及血小板降低，筆者對本院2009年5月~2010年12月收治的86例惡性腫瘤化療患者進行研究，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

本院2009年5月～2010年12月收治的86例惡性腫瘤患者，其中，男39例，女47例，年齡26~73歲，平均52歲，胃癌25例，結(jié)直腸癌53例，乳腺癌8例。將86例惡性腫瘤患者隨機分為兩組，治療組44例，其中胃癌14例，結(jié)直腸癌26例，乳腺癌4例，對照組42例，其中胃癌11例，結(jié)直腸癌27例，乳腺癌4例。兩組患者的年齡、性別、所患疾病等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 治療方法

治療組在化療結(jié)束后24 h給予皮下注射重組人粒巨噬細胞刺激因子100 μg/d，以3 d為1個療程。對照組化療前1 d開始口服鯊肝醇，50 mg/次，3次/d，7 d為1個療程。兩組相同的疾病所給予的化療方案、藥物劑量及給藥時間完全相同，主要化療方案為：胃癌結(jié)直腸癌采用folfox4方案，乳腺癌采用TAC（多西他賽、表阿霉素、環(huán)磷酰胺）?；熃Y(jié)束后7 d查血常規(guī)，比較兩組的白細胞及血小板降低情況。

1.3 療效評定標準

白細胞低于4.0×109/L為白細胞減少、血小板低于100×109/L為血小板減少，比較兩組白細胞及血小板減少有無差異。

1.4 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計分析采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件包進行處理，對結(jié)果進行χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

治療組白細胞下降5例、血小板減少3例，對照組白細胞下降18例、血小板減少11例，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義，說明重組人粒巨噬細胞刺激因子能有效的防治化療后白細胞及血小板減少癥。見表1。

3 討論

化療藥物引起的毒副反應(yīng)對化療的應(yīng)用有一定的影響，常見的毒副反應(yīng)是骨髓抑制，骨髓抑制的發(fā)生主要是由于化療藥物對骨髓干細胞的直接損傷和對骨髓基質(zhì)細胞、微循環(huán)結(jié)構(gòu)或功能損傷所致，造成骨髓抑制的程度及持續(xù)時間與藥物種類和劑量有關(guān)[1]。而骨髓抑制不但影響治療的繼續(xù)進行，而且易導致細菌、真菌等微生物的感染，或者出血性疾病的發(fā)生，加重病情。雖然輸注血小板可以緩解血小板減少，但這種作用是暫時的，同時還可能帶來感染、輸血反應(yīng)和抗體產(chǎn)生等其他問題[2]。因此，在臨床上對促進白細胞及血小板生長因子的需要十分迫切。在尋找血小板因子的過程中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了促血小板生長素（TPO）、干細胞因子、白介素1、3、6、11和粒細胞集落刺激因子（GM）以及巨噬細胞集落刺激因子等。rhGM-CSF作為生長因子作用于造血干細胞，促進其增殖和分化，刺激粒、單核巨噬細胞成熟，促進成熟細胞向外周血釋放，并能促進巨噬細胞及噬酸性細胞的多種功能，還作用于目前已知體內(nèi)功能最強的抗原提呈細胞-樹突狀細胞，以促進免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[3-4]。在臨床實踐中，rhGM-CSF已經(jīng)成功的用于治療對惡性腫瘤放、化療所致黏膜糜爛、潰瘍[5]。另外，GM-CSF在治療真菌感染中也能夠發(fā)揮良好的作用[6]，Peter BG等[7]對145例進行自體干細胞移植患者的真菌感染情況進行了回顧性分析，發(fā)現(xiàn)采用rhGM-CSF治療的70例患者中有2例存在真菌感染，發(fā)生率為2.9%；而在對照組，75例患者中有9例發(fā)生真菌感染，發(fā)生率為12%，兩者之間存在明顯差異，另外還發(fā)現(xiàn)有10例死亡患者，其中5例的死亡原因是真菌感染，且這5例中有4例是未用rhGM-CSF治療的。最近研究發(fā)現(xiàn)rhGM-CSF用于治療燒傷創(chuàng)面也有著很好的療效[8]。

本文通過對44例惡性腫瘤患者化療后應(yīng)用rhGM-CSF制劑進行對照研究，結(jié)果治療組中白細胞下降5例、血小板減少3例，而在對照組，42例患者中有18例白細胞下降、11例血小板減少，經(jīng)過統(tǒng)計學處理，P＜0.05，兩者之間存在明顯差異。因此筆者研究證實rhGM-CSF能有效的防治化療后白細胞及血小板減少癥，使得化療能順利進行。

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第5篇：巨噬細胞范文

【摘要】 目的 研究穿心蓮內(nèi)酯對小鼠巨噬細胞氧化亞氮(NO)、腫瘤壞死因子(TNFα)和白細胞介素6(IL6)生成的影響。方法 培養(yǎng)小鼠巨噬細胞RAW264.7，分別加入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，終質(zhì)量濃度1 μg/mL)和不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯(終濃度1、10、50 μmol/L)進行干預(yù)，并設(shè)空白組和穿心蓮內(nèi)酯單獨作用組作為對照。取培養(yǎng)24 h細胞上清，用Griess法檢測NO產(chǎn)量;用Elisa法檢測TNFα、IL6濃度。結(jié)果 與空白組比較，LPS明顯促進了RAW264.7細胞NO、TNFα、IL6等炎癥因子的生成;穿心蓮內(nèi)酯單獨作用不影響炎癥因子的表達，但穿心蓮內(nèi)酯能顯著下調(diào)LPS誘導的炎癥因子表達，與LPS組差異有顯著性。結(jié)論 穿心蓮內(nèi)酯可明顯降低LPS誘導的巨噬細胞炎癥因子表達，抑制炎癥反應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】 穿心蓮內(nèi)酯;巨噬細胞;炎癥因子;內(nèi)毒素

)Abstract:Objective To investigate the inhibitive effects of andrographolide on lipopolysaccharideinduced inflammation factors secretion in macrophage cells.Methods A macrophage cell line RAW264.7 cells were cultured in vitro，and treated with different concentration of andrpgrapholide in the presence or absence of lipopolysaccharide (LPS). The production of inflammatory factor nitric oxide (NO)，tumor necrosis factorα(TNFα) and interleukin6 (IL6) in the supernatant was measured by Griess reagent and Elisa，respectively.Results After stimulated with LPS，the content of NO，TNFα and IL6 were markedly upregulated. Pretreated with andrographolide significantly inhibited LPSinduced inflammation factors expression levels，which was statistically significant compared with LPS group(P

Key words:andrographolide;macrophage cells; inflammation factor; lipopolysaccharide

目前，炎癥在心血管疾病、腫瘤中的促進作用日漸受到重視，抑制炎癥反應(yīng)防治心血管疾病及腫瘤成為研究的重點[1-2]。穿心蓮為爵床科植物穿心蓮屬植物穿心蓮干燥地上部分，作為常用中藥，具有清熱解毒、涼血消腫等功效。穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮的主要藥效成分，有研究表明，穿心蓮內(nèi)酯有顯著的抗炎活性，能抑制二甲苯和醋酸所致的小鼠毛細血管通透性增加，還對大鼠蛋清蛋白、角叉菜膠足趾注射致炎模型有明顯的抗炎作用[3]。炎癥反應(yīng)時，巨噬細胞在細菌及其內(nèi)毒素的刺激下，分泌大量的炎癥因子，如氧化亞氮(NO)、TNFα和IL1β等，這些炎癥因子又可以進一步活化巨噬細胞，形成惡性循環(huán)，加重炎癥反應(yīng)。本研究通過觀察穿心蓮內(nèi)酯對NO、TNFα和IL1β等炎癥因子表達的影響，探討其抗炎活性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

穿心蓮內(nèi)酯(四川廣漢市維康植化有限公司);細菌內(nèi)毒素(LPS，E coli Serotype 055:B5，美國Sigma公司);NO檢測試劑盒(南京建成生物公司);TNFα、IL6 Elisa檢測試劑盒(美國R&D公司);胎牛血清(杭州四季青公司);DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);酶標儀(美國BioRad公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及干預(yù)實驗

小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞由本室保存。用完全DMEM培養(yǎng)基(含體積分數(shù)10%胎牛血清、質(zhì)量濃度100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，體積分數(shù)5%CO2，37 ℃條件下傳代培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的RAW264.7細胞，質(zhì)量分數(shù)0.25%胰酶消化，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，接種到24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細胞生長至80%融合后，加入不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯(終濃度分別為1、10、50 μmol/L)孵育1 h，然后加入LPS(終質(zhì)量濃度1 μg/mL)進行刺激。實驗分組：正常對照組、穿心蓮內(nèi)酯單獨作用組、LPS組和穿心蓮內(nèi)酯加LPS組。

1.3 NO濃度測定

細胞加入刺激物后培養(yǎng)24 h，收集各處理組細胞培養(yǎng)上清液，用硝酸還原酶法檢測炎性介質(zhì)NO的濃度。操作步驟按試劑盒說明書完成。

1.4 細胞因子濃度測定

細胞加入刺激物后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各處理組細胞培養(yǎng)上清液，用TNFα和IL6 Elisa試劑盒檢測上清液中細胞因子的含量。操作步驟按試劑盒說明書完成。

1.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行Student’s t檢驗，P

2 結(jié)果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯對LPS誘導巨噬細胞NO生成的影響

收集24 h細胞培養(yǎng)上清，用Griess法測定細胞上清中NO 的含量。結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，50 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯單獨作用并不影響巨噬細胞NO的表達(與正常對照組比較，P>0.05);1 μg/mL LPS刺激可以顯著誘導巨噬細胞RAW 264.7產(chǎn)生NO，而穿心蓮內(nèi)酯預(yù)干預(yù)能明顯抑制LPS引起的NO的釋放，并在1～50 μmol/L濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。表1 穿心蓮內(nèi)酯對NO分泌的影響

2.2 穿心蓮內(nèi)酯對LPS誘導巨噬細胞TNFα、IL6生成的影響

結(jié)果見表2。Elisa檢測結(jié)果顯示，在正常情況下巨噬細胞RAW264.7培養(yǎng)上清中TNFα、IL6含量極低，50 μmol/L濃度的穿心蓮內(nèi)酯單獨作用對其表達也無明顯影響(與正常對照組比較，P>0.05)。當用1 μg/mL LPS刺激后，巨噬細胞TNFα和IL6的表達均明顯增高，與正常對照組比較，P

3 討論

近年來，炎癥在多種疾病中，尤其是心血管疾病和腫瘤中的作用引起了廣泛的關(guān)注。根據(jù)在動脈粥樣硬化斑塊有多種炎性細胞和炎癥因子存在等證據(jù)，Ross明確提出了動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的“炎癥學說”，指出慢性炎癥反應(yīng)是AS的主要發(fā)病機制[4]。隨后的研究證實，進入血管壁的巨噬細胞可被氧化型低密度脂蛋白、革蘭陰性菌及其LPS活化，通過NFκB、iNOS和COX等途徑產(chǎn)生TNFα、IL6、NO、PGs等多種炎癥介質(zhì)，促進AS斑塊的形成和發(fā)展，而抑制炎癥反應(yīng)可改善AS病變程度，進一步說明了炎癥在AS中的關(guān)鍵性作用[5]。炎癥與腫瘤的關(guān)系很早就引起了人們的關(guān)注。現(xiàn)代研究認為，炎癥細胞主要通過分泌IL1、IL6、TNFα、NO、PGs及活性氧等炎癥因子，參與組成腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤的進程。這些炎癥因子不僅能誘導正常細胞的惡性病變，還可以促進腫瘤細胞增殖，抑制細胞凋亡，誘導腫瘤血管形成，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中有重要作用[6]。2009年，Mantovani在Nature雜志上提出，與無限制性生長、轉(zhuǎn)移等特征一樣，炎癥性微環(huán)境與腫瘤關(guān)系密切，并認為炎癥是腫瘤的7大重要標志之一[2]?！”? 穿心蓮內(nèi)酯對TNFα和IL6表達的影響

與正常對照組比較：**P

參考文獻

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第6篇：巨噬細胞范文

【關(guān)鍵詞】 白藜蘆醇；微小RNA-146a；肺泡巨噬細胞；腫瘤壞死因子-α

Effect of ResveRatRol on expRession of lipopolysacchaRide-induced micRoRNA-146a in alveolaR macRophages Zeng Zhenguo，Shao Qiang，Li Yong，Ding Chengzhi， Qing Cheng， Liu Fen， Zhan Yian， Nie Cheng， Jie Kemin， Gong Honghan， Qian Kejian. DepaRtment of CRitical CaRe Medicine， FiRst Affiliated Hospital， Medical College of Nanchang UniveRsity， Nanchang 330006， China

CoRResponding authoR： Qian Kejian，Email：qkj0607@sohu，com

【AbstRact】Objective To obseRve the effect of ResveRatRol on expRession of lipopolysacchaRide （LPS） -induced micRoRNA-146a （miR-146a） in alveolaR macRophages. Methods Rat alveolaR macRophages（NR8383）weRe seeded at 2×106cell/poRe in 6 well plates in vitRo and incubated foR 90 min. NR8383 weRe Randomly divided into fouR gRoups： contRol gRoup， NR8383 stimulated with phosphate buffeR solution （PBS）； LPS-stimulated gRoup， NR8383 stimulated with 1μg/mL of LPS； ResveRatRol-tReated gRoup， NR8383 tReated with diffeRent concentRations of ResveRatRol （1 μg/mL oR 10 μg/mL） foR 30 min， then stimulated with 1 μg/mL of LPS. AfteR incubation foR 6 h， the cells weRe haRvested and the supeRnatant of cell cultuRe medium was collected. The expRession of miR-146a of cells was detected by using fluoRoilluminance Real-time quantitative PCR device， and the levels of TNF-α pRotein in the supeRnatant weRe assayed by using enzyme-linked immunosoRbent assay （ELISA）.Results CompaRed with contRol gRoup， the expRession of miR-146a and the level of TNF-α weRe significantly incReased in LPS stimulated gRoup （miR-146a’ s expRession folds： 5，92±1，57 vs 1，03±0，58，P

【Key woRds】ResveRatRol； MicRoRNA-146a； AlveolaR macRophages； TumoR necRosis factoR-α

大量臨床及實驗研究表明，白藜蘆醇對膿毒癥肺損傷具有保護作用[1-5]。微小RNA-146a（miR-146a）是TLRs/NF-κB炎癥通路中重要的負反饋調(diào)控介質(zhì)，能夠抑制炎癥反應(yīng)[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a參與了肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)，有望成為抑制肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)的新途徑[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇與miRNA關(guān)系密切，有可能通過miRNA發(fā)揮其抗炎作用[9-11]。然而，在肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)模型中，白藜蘆醇是否影響miR-146a的表達以及是否通過上調(diào)miR-146a的表達來抑制炎癥介質(zhì)釋放均未見報道。

1 材料與方法

1，1 實驗材料

大鼠肺泡巨噬細胞株NR8383（中國科學院細胞庫），胎牛血清（美國HyClone），Ham’ s F-12K培養(yǎng)基（美國Sigma-AldRich），LPS（E，coli 0111∶ B4，美國Sigma-AldRich），白藜蘆醇（美國Enzo life sciences），TRIzol Reagent（美國InvitRogen），四甲基偶氮唑鹽（MTT，北京索來寶科技有限公司），TaqMan UniveRsal 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測試劑盒、TaqMan MicRoRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan MicRoRNA 檢測試劑盒（美國ABI），十二烷基硫酸鈉（SDS，美國Sigma-AldRich），大鼠TNF-α ELISA試劑盒（上海明睿生物），氯仿、異丙醇、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1，2 細胞培養(yǎng)

R8383細胞培養(yǎng)于含15%FBS、1，5 g/L碳酸氫鈉、2 mmol L-谷氨酰胺的Ham’ s F-12K完全培養(yǎng)基中，置于大氣壓下37 ℃、含5%體積分數(shù)CO2的溫濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d更換培養(yǎng)液，3～4 d傳代1次。

1，3 MTT比色法檢測白藜蘆醇對細胞活性的影響

取指數(shù)生長期NR8383細胞，按每孔細胞0，5×104個接種至96孔板。細胞貼壁90 min后，分別加入0，1、1、10、50、100 μg/mL終質(zhì)量濃度的白藜蘆醇，每組設(shè)5個復孔，同時設(shè)陰性對照組（等體積PBS替代白藜蘆醇）和陽性對照組（等體積10%二甲亞砜替代白藜蘆醇）。加藥后細胞再培養(yǎng)48 h，加入5 g/L MTT 溶液20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入三聯(lián)溶解液100 μL/孔，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育8 h，用酶標儀（波長570 nm）測定各孔的吸光度（OD 570 nm）值。

1，4 細胞處理及分組

取指數(shù)生長期NR8383細胞，按每孔細胞2×106個接種至6孔板。細胞培養(yǎng)90 min后，分為以下四組：（1） LPS處理組：培養(yǎng)板中加入LPS溶液（終質(zhì)量濃度1 μg/mL）；（2） PBS對照組：培養(yǎng)板中加入等體積PBS溶液；（3） 白藜蘆醇+LPS組：培養(yǎng)板中加入不同濃度白藜蘆醇溶液（終質(zhì)量濃度1 μg/mL、10 μg/mL）預(yù)處理30 min后，加入LPS溶液（終質(zhì)量濃度1 μg/mL）。細胞培養(yǎng)6 h后，離心收集細胞上清液和細胞團塊，保存于-80 ℃冰箱，分別用于ELISA檢測和細胞總RNA提取。

1，5 檢測指標及方法

1，5，1 TNF-α蛋白測定 收集各組細胞培養(yǎng)上清液，檢測按照ELISA試劑盒使用說明書進行檢測。

1，5，2 miR-146a表達測定 采用TRIzol法提取細胞中的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性及純度，紫外分光光度計測定總RNA濃度。采用TaqMan MicRoRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用TaqMan UniveRsal 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測試劑盒進行PCR擴增，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 Rain；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個擴增循環(huán)，在ABI 7500定量PCR儀上擴增和檢測。操作均按說明書進行，所有操作均在冰上完成。選取U6 snRNA作為內(nèi)參照，miR-146a的相對表達量采用2-Ct計算。

1，6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13，0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P

2 結(jié)果

2，1 MTT比色法檢測白藜蘆醇對NR8383

細胞活性的影響

白藜蘆醇在0，1～100 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對NR8383細胞無毒性作用。見圖1。

2，2 TNF-α蛋白含量及細胞內(nèi)miR-146a的表達變化

表1顯示，與PBS對照組相比，LPS處理組TNF-α蛋白含量及miR-146a表達均明顯升高（P

3 討論

膿毒癥并發(fā)急性肺損傷是膿毒癥高病死率的主要原因[12，13]，如果發(fā)生膿毒癥時避免或減輕肺損傷的發(fā)生，將有助于提高膿毒癥患者的成功救治率。肺組織中最多的非實質(zhì)性細胞是肺泡巨噬細胞[14]，膿毒癥發(fā)生時，肺泡巨噬細胞內(nèi)TLRs/NF-κB炎癥通路活化，導致大量炎癥基因的轉(zhuǎn)錄活化，失控性釋放大量炎癥因子，形成肺內(nèi)炎癥“瀑布”反應(yīng)，導致ALI的發(fā)生。LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要致病成分，是導致TLRs/NF-κB活化的常見因子。本研究結(jié)果顯示，LPS刺激肺泡巨噬細胞后，導致TNF-α分泌顯著增加。

白藜蘆醇是一種多酚類化合物，是天然的植物抗菌素。它能夠抑制肺泡巨噬細胞的活化，減少細胞內(nèi)炎癥因子的釋放，避免或減輕膿毒癥時肺損傷，提高膿毒癥時肺損傷的治療效果[1-5，15]。本實驗研究也證實，白藜蘆醇預(yù)處理大鼠肺泡巨噬細胞后，能明顯抑制LPS誘導的炎癥因子TNF-α 的產(chǎn)生，并且其抑制作用呈劑量依賴性。

miRNAs是一類小的內(nèi)源性非編碼RNA，通過識別靶基因mRNA的3’ 端非編碼區(qū)來抑制靶蛋白的翻譯或促進靶基因的降解[16-17]。miRNAs通過抑制炎癥相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達，在炎癥反應(yīng)調(diào)控中具有重要作用。miR-146a在TLRs/NF-κB通路中具有重要調(diào)控作用。它的靶基因是TLRs/NF-κB通路中的兩個重要接頭蛋白編碼基因IRAK-1和TRAF-6。miR-146a上調(diào)后將負性調(diào)控TLRs/NF-κB通路，能夠抑制炎癥介質(zhì)的升高[6，18]。并且已證實miR-146a參與調(diào)節(jié)了LPS誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)[7-8]。在本實驗中，用LPS刺激肺泡巨噬細胞后，也誘導了miR-146a的表達上調(diào)，與前者報道結(jié)果相似。

研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過影響miRNA前體的轉(zhuǎn)錄和miRNA的加工成熟，能特異性地引起一些miRNAs改變，包括miR-21、miR-146a、miR-663等，這些miRNAs都參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇預(yù)處理大鼠肺泡巨噬細胞后，能明顯促進miR-146a的表達上調(diào)，并且相比于較低質(zhì)量濃度白藜蘆醇組（1 μg/mL組），較高質(zhì)量濃度白藜蘆醇組（10 μg/mL）更能誘導miR-146a的表達。

綜上所述，在LPS誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)中，白藜蘆醇能夠抑制炎癥因子TNF-α的產(chǎn)生，并上調(diào)miR-146a的表達，由此筆者可以推測，白藜蘆醇調(diào)控炎癥的機制之一可能是通過升高細胞內(nèi)miR-146a的表達水平來發(fā)揮其抗炎作用。

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（收稿日期：2013-05-07）

DOI：10，3760/cma，j，issn，1671-0282，2014，01，009

基金項目：國家自然科學基金（81060152）；江西省自然科學基金（2009GZY0215）

作者單位：330006 南昌，南昌大學第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科（曾振國、邵強、丁成志、卿城、劉芬、詹以安、聶成、錢克儉），腫瘤科（李勇），影像科（龔洪翰）；南昌大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室（揭克敏）

第7篇：巨噬細胞范文

［摘要］目的:觀察亞硒酸鈉與硫酸鎂單獨及聯(lián)合應(yīng)用對染塵肺泡巨噬細胞丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）及過氧化氫酶（CAT）水平變化的影響，尋找二者的最佳劑量組合。方法:采用大鼠肺灌洗法純化獲得肺泡巨噬細胞（1×109 L-1），同時加入SiO2及不同濃度的亞硒酸鈉溶液、硫酸鎂溶液、亞硒酸鈉+硫酸鎂溶液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)18 h后，檢測MDA、H2O2含量及CAT活性。結(jié)果:亞硒酸鈉與硫酸鎂單獨以及兩者聯(lián)合應(yīng)用都可以使SiO2染毒的肺泡巨噬細胞MDA及H2O2含量下降，CAT活性有所增高，且以10μmol?L-1亞硒酸鈉與10μmol?L-1硫酸鎂聯(lián)合作用效果最好。結(jié)論:亞硒酸鈉與硫酸鎂在體外可有效拮抗SiO2粉塵的細胞毒性作用，二者合用效果更佳。

［關(guān)鍵詞］二氧化硅;亞硒酸鈉;硫酸鎂;肺泡巨噬細胞;氧化損傷;大鼠

硒與鎂是人體必需的元素，具有許多極為重要的生理生化作用，參與機體多種酶的構(gòu)成，在體內(nèi)抗氧化過程中發(fā)揮重要作用。已有研究證明，硒在體外有一定拮抗粉塵細胞毒性的作用［12］。硫酸鎂在拮抗SiO2細胞毒性的作用與及硒、鎂兩種物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用的研究尚未見報道。本研究主要探討硒、鎂兩種元素單獨及聯(lián)合應(yīng)用對染塵巨噬細胞丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）含量及過氧化氫酶（CAT）活性的影響，以期為礦物元素應(yīng)用于矽肺的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

11 材料

111 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220g，由本校實驗動物中心提供。

112 石英粉塵 采用標準的SiO2粉塵，由中國預(yù)防醫(yī)學科學院提供，游離SiO2的含量大于97％，粒徑小于5μm的占95％以上，臨用前新鮮研磨后用生理鹽水配成10g?L-1的懸液待用。

113 RPMI 1640培養(yǎng)液 日本產(chǎn)RPMI 1640培養(yǎng)基干粉，每袋104g，溶于1 000ml去離子水，抽濾除菌并分裝，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?nèi)含2mmol?L-1的L谷氨酰胺、100U?ml-1青霉素、100μg?ml-1鏈霉素。臨用前加入10%小牛血清。

114 亞硒酸鈉（Na2SeO3） 由上海金山縣興塔化工廠生產(chǎn)，分析純，批號：940802，臨用前用生理鹽水配成1.0mmol?ml-1的溶液待用。

115 硫酸鎂（MgSO4） 由上海試四赫維化工有限公司生產(chǎn)，分析純，批號：041107，臨用前用生理鹽水配成05mmol?ml-1的溶液待用。

116 MDA、H2O2、CAT試劑盒 由南京建成生物工程研究所提供。

12 方法

121 肺泡巨噬細胞（AM）的獲取與培養(yǎng) 大鼠股動脈放血處死，在無菌條件下進行肺灌洗，收集灌洗液，細胞純化后調(diào)整濃度為1×109 L-1。按實驗設(shè)計分成：（1）陰性對照組（生理鹽水）。（2）SiO2組，含SiO2200μg?ml-1。（3）Na2SeO3組，內(nèi)含SiO2200μg?ml-1外，Na2SeO3設(shè)05、10、20μmol?L-1 3個濃度。（4）MgSO4組，內(nèi)含SiO2200μg?ml-1外，MgSO4設(shè)05、10、20μmol?L-1 3個濃度。 （5）Na2SeO3與MgSO4聯(lián)合應(yīng)用組，內(nèi)含SiO2200μg?ml-1外，Na2SeO3與MgSO4各按上述3種劑量采用正交表L9(34)的設(shè)計，共9個劑量組。均于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后檢測各指標。

122 檢測指標 MDA、H2O2、CAT均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，操作方法嚴格按照說明書進行。

13 統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS82軟件進行完全隨機設(shè)計資料方差分析及正交實驗設(shè)計方差分析。

2 結(jié)果

21 Na2SeO3單獨作用對染塵AM MDA、H2O2和CAT水平的影響

SiO2粉塵組AM中MDA及H2O2含量增加，CAT的活性降低，與陰性對照組比較，具有統(tǒng)計學意義(P< 005)。不同劑量Na2SeO3單獨作用后MDA及H2O2含量下降，CAT活性有所增高，其中以加入的20μmol?L-1 Na2SeO3組的效果最明顯。見表1。

表1 Na2SeO3單獨作用18 h后染塵AM中MDA、H2O2含量和CAT活性的變化（略）

注：A組為200mg?L-1 SiO2;B組為200mg?L-1 SiO2+05μmol?L-1 Na2SeO3;C組為200mg?L-1 SiO2+10μmol?L-1 Na2SeO3;D組為200mg?L-1 SiO2+20μmol?L-1 Na2SeO3

1)與A組比較，P

22 MgSO4單獨作用對染塵AM MDA、H2O2和CAT水平的影響SiO2粉塵組AM中MDA及H2O2含量增加，CAT的活性降低，與陰性對照組比較，具有統(tǒng)計學意義(P

表2 MgSO4單獨作用18 h后染塵AM中MDA、H2O2含量和CAT活性的變化（略）

注：A組為200mg?L-1 SiO2;B組為200mg?L-1 SiO2+ 05μmol?L-1 MgSO4;C組為200mg?L-1 SiO2+ 10μmol?L-1 MgSO4;D組為200mg?L-1 SiO2+ 20μmol?L-1 MgSO4。A組為200mg?L-1 SiO2;B組為200mg?L-1 SiO2+05μmol?L-1 Na2SeO3;C組為200mg?L-1 SiO2+10μmol?L-1 Na2SeO3;D組為200mg?L-1 SiO2+20μmol?L-1 Na2SeO3

1)與A組比較，P

23 Na2SeO3與MgSO4聯(lián)合作用對染塵AM MDA、H2O2和CAT水平的影響SiO2組AM中MDA及H2O2含量增加，CAT的活性降低，與陰性對照組比較，具有統(tǒng)計學意義(P

表3 Na2SeO3與MgSO4聯(lián)合作用18 h后染塵AM中MDA、H2O2、CAT的變化（略）

1)與200mg?L-1 SiO2組比較，P

3 討論

SiO2致肺泡AM損傷是矽肺發(fā)病的重要環(huán)節(jié)之一，SiO2粉塵進入機體后可引發(fā)肺泡巨噬細胞的自由基和脂質(zhì)過氧化自由基反應(yīng)。硒、鎂是人體必需的元素， 參與機體多種酶的組成，涉及生物體內(nèi)的細胞代謝，具有重要的生理功能。研究證實，硒、鎂和矽肺之間有密切相關(guān)的聯(lián)系［34］。MDA作為脂質(zhì)過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，可通過共價烷化賴氨酸、組氨酸和半胱氨酸對蛋白質(zhì)加以修飾，引起蛋白變性［5］。MDA可以與蛋白質(zhì)游離氨基作用，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián)［6］。Hartley等［7］用四氯化碳、鐵/抗壞血酸誘發(fā)肝細胞脂質(zhì)過氧化，采用兔多克隆抗體測定MDA加合物，發(fā)現(xiàn)了13種丙二醛修飾蛋白。MDA 與蛋白結(jié)合后可導致蛋白對酶解作用的敏感性下降［8］。過多的H2O2和超氧化物反應(yīng)可形成活性更強的?OH，后者參與脂質(zhì)氧化的鏈式反應(yīng)，還可直接結(jié)合到DNA上形成羥化反應(yīng)；H2O2可被髓過氧化物酶代謝，產(chǎn)生的衍生物次鹵酸，也有很強的活性［5］。自由基的清除依賴于非酶類抗氧化劑和酶類抗氧化劑。CAT是重要的酶類抗氧化劑，廣泛分布于各種組織細胞中，在H2O2濃度較高時，可催化H2O2轉(zhuǎn)變成H2O與O2。硒與硒的化合物在消除自由基、抗脂質(zhì)過氧化方面發(fā)揮重要作用，可清除脂質(zhì)過氧化自由基中間產(chǎn)物，分解脂質(zhì)氫過氧化物，修復自由基引起的硫化物的分子損傷，在自由基破壞生命物質(zhì)前將其清除或轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定化合物，還能催化巰基化合物作為保護劑的反應(yīng)。有研究表明，鎂可減少缺血后再灌注心肌乳酸脫氫酶的漏出， 維持谷胱甘肽過氧化物酶的活性，降低心肌組織中的丙二醛含量，從而減少氧自由基的產(chǎn)生，起到抗脂質(zhì)過氧化而保護心肌細胞的作用［911］，Mg 2+對內(nèi)皮細胞及培養(yǎng)乳鼠心肌細胞羥自由基誘導的脂質(zhì)損傷有保護作用［1213］，鎂還作為鈣的拮抗劑減少自由基的生成，減輕膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)［14］。

［參考文獻］

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第8篇：巨噬細胞范文

學意義; 甘露糖不能誘導Mφ分泌TNFα與IL4。結(jié)論: RTP引起的Mφ分泌TNFα作用是通過甘露糖受體介導， 而APS的作用不僅僅與甘露糖受體有關(guān)。兩種多糖與甘露糖受體的作用差異可能與其單糖組成密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 巨噬細胞 甘露糖受體 大黃多糖 當歸多糖 腫瘤壞死因子 白細胞介素4

許多中藥多糖能夠刺激巨噬細胞（Macrophage， Mφ）釋放前炎癥因子或者某些細胞因子， 推測其可能機制與Mφ膜上的模式識別受體（pathogen recognition， PRR）結(jié)合引起細胞內(nèi)某些信號通路的活化有關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)， 當歸多糖（Angelica sinensis Diel polysaccharide， APS）能夠促進樹突狀細胞的成熟， 增強抗原提呈能力［1， 2］; 促進脾細胞IL2、 IFNγ的分泌［3］; 而RTP（Rheum tanguticum polysaccharide， RTP）能夠?qū)菇Y(jié)腸炎大鼠CD4+T細胞的擴增， 降低克隆氏病大鼠IFNγ的升高， 升高結(jié)腸炎小鼠降低的IL4水平［4， 5］。但是RTP和APS的免疫反應(yīng)作用機制， 尚不清楚。

Mφ是體內(nèi)特定的吞噬細胞和抗原提呈細胞， 是連接先天免疫系統(tǒng)及后天免疫系統(tǒng)的橋梁。其表面眾多膜受體參與完成這些功能， Mφ甘露糖受體(Macrophage Mannose receptor， MMR)為其中之一。研究表明， MR是一種PRR， 可特異性地識別以甘露糖、 N乙酰葡糖胺或巖藻糖為末

端的配體并與之結(jié)合［6］， 這些配體可來源于內(nèi)源性或外源性分子。推測MR在病原體的識別、 吞噬與清除， 在結(jié)核、 腫瘤、 感染等許多疾病過程中都發(fā)揮著重要的作用。我們的研究表明， RTP含有近50%的甘露糖［7］， 組分RTP1， RTP2所含單糖比例不同; APS則含有N乙酰

葡糖胺殘基［1］， 組分APS1， APS2， APS3所含單糖比例也不同。這兩種多糖的免疫調(diào)節(jié)作用可能是通過MMR而起效的。本研究將探討APS混合組分、 RTP混合組分對Mφ吞噬及分泌細胞因子的影響， 以揭示兩種中藥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠（200～220 g， 雌雄各半）， 由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供， 動物分籠飼養(yǎng)于空調(diào)溫室內(nèi)， 溫度22±2℃， 相對濕度50%～60%， 自動調(diào)控晝夜各12 h， 顆粒飼料喂養(yǎng)， 自由飲水。RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司， 胎牛血清購自杭州四季青公司生物制品廠， PBS緩沖液購自博士德生物工程公司， 甘露糖購自上海試劑二廠; 半乳糖購自國藥集團化學試劑有限公司; APS及RTP由我實驗室提供， EDTA以及異硫氰酸熒光素標記的甘露糖化牛血清白蛋白(ManFITCBSA) 購自Sigma公司; GENios pro多功能酶標儀為瑞士TENCN公司產(chǎn)品; Nikon H600L熒光顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 腹腔Mφ的分離、 純化及培養(yǎng)

取6只雌性SD大鼠， 乙醚麻醉， 750 mL/L乙醇浸泡1 min， 取出， 消毒腹部皮膚， 打開腹壁， 但勿傷及腹膜。用注射器向腹腔內(nèi)注入PBS 10 mL， 輕揉腹腔5 min， 剪開腹膜， 用吸管吸取腹腔內(nèi)液體， 注入離心管， 1 000 r/min 離心5 min。棄上清， 分別加入6 mL含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液， 吹打混勻后計數(shù)， 調(diào)整細胞密度為1×109個/L， 分別接種腹腔Mφ于對應(yīng)的培養(yǎng)板中， 置37℃ 50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。3 h后輕輕吸棄培養(yǎng)液后， 再用PBS洗去未貼壁細胞， 重復3次， 每孔加入含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液， 用姬姆薩瑞氏染色法染色， 觀察Mφ占 95％以上［8］。純化后的單層大鼠腹腔Mφ用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液置于37℃ 50

mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 熒光顯微鏡觀察MFITCBSA與Mφ的結(jié)合能力

取純化腹腔Mφ， 以每孔1×106個腹腔Mφ接種于底部覆蓋玻片的6孔培養(yǎng)板， 純化后分為3組: 空白對照組（2 mL 500 mL/L RPMI1640/PBS緩沖液）; ManFITCBSA陽性對照組（2 mL 0.01 g/L ManFITCBSA）; 甘露糖加MFITCBSA實驗組（1 mL 1 g/L Man+1 mL 0.01 g/L ManFITCBSA）。用錫鉑紙包嚴培養(yǎng)板， 置37℃ 50 mL/L CO2孵箱中避光孵育60 min; 用PBS沖洗接種有Mφ的蓋玻片3遍， 40 g/L多聚甲醛固定30 min， PBS洗片， 晾干后滴上500 mL/L的甘油PBS 10 μL， 石蠟封片， 4℃短時儲存留待觀察。熒光顯微鏡激發(fā)光譜495 nm， BA520阻擋濾光片， DM505二向分色濾光片。

1.2.3 多糖對Mφ吞噬ManFITCBSA的影響

取純化腹腔Mφ， 以每孔1×104個接種于Costar96孔底部透明板， 置37℃及4℃， 50 mL/L CO2孵箱中孵育4 h， PBS沖洗3遍， 分別加入不同濃度的甘露糖（Man）、 半乳糖(GaL)、 APS混合組分、 RTP混合組分以及ManFITCBSA， 每組3個孔各加100 μL， 置37℃及4℃， 50 mL/L CO2孵箱中避光孵育60 min后， 棄上清， PBS沖洗3遍， 重復3次［9］。

1.2.4 多糖對Mφ分泌細胞因子的影響

取純化Mφ， 以每孔1×104個腹腔Mφ接種于Costar96孔培養(yǎng)板， 分別與APS、 RTP、 Man、 APS+ Man

、 RTP+ Man在37℃， 50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)36 h， 取細胞上清按照試劑盒說明（Rat IL4 ELISA Kit， Rat TNFα ELISA Kit， BOSTER）測定細胞因子水平。簡述如下: 在酶標板加入100 μL不同濃度的標準品， 繪制標準曲線， 在反應(yīng)孔中加入待測樣品的Mφ培養(yǎng)液上清各100

μL， 然后加入100 μL生物素標記抗體， 37℃反應(yīng)1 h， 0.01 mol/L PBS洗板3次， 然后每孔加入100 μL親和素過氧化物酶復合物（ABC）， 37℃反應(yīng)30 min， 洗板5次， 加入TMB顯色液， 避光反應(yīng)10～25 min， 加入TMB中止液， 450 nm測定光吸收值。

1.2.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以x±s表示， 利用SPSS11.0軟件進行分析， 顯著性檢驗采用t檢驗及SNKq檢驗， P

2 結(jié)果

2.1 甘露糖抑制Mφ吞噬ManFITCBSA 采用熒光顯微鏡觀察腹腔Mφ吞噬ManFITCBSA的情況(圖1A)， 通過競爭抑制試驗觀察到: D甘露糖可以抑制該現(xiàn)象(圖1B)。

2.2 多糖對Mφ吞噬功能的影響

采用多功能酶標儀檢測Mφ吞噬ManFITCBSA的能力， 實驗結(jié)果表明: 在37℃時， Mφ吞噬活性與ManFITCBSA濃度呈正相關(guān)， 在4℃時， ManFITCBSA與Mφ為非特異性吸附， 熒光強度不隨ManFITCBSA濃度改變而發(fā)生變化（圖2）; ManFITCBSA與MMR的結(jié)合為Ca2+依賴性， EDTA可阻斷該過程（圖3）， 其阻斷能力與EDTA濃度呈正

相關(guān); 甘露糖作為MR的阻斷劑， 也阻斷該過程， 其拮抗能力與甘露糖濃度相關(guān)， 半乳糖則不能阻斷MR介導的Mφ對ManFITCBSA的吞噬作用（圖4）; APS、 RTP均可阻滯Mφ吞噬ManFITCBSA的作用， 且呈劑量依賴性(圖5、 6)。

2.3 多糖刺激Mφ釋放TNFα， IL4的測定

采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液中TNFα和IL4水平， 體外將APS和RTP與Mφ共孵育36 h， 可以促進正常腹腔Mφ分泌TNFα(圖6)， 與正常對照組相比有統(tǒng)計學意義（P

3 討論

我們已發(fā)現(xiàn)， RTP與APS均具有免疫調(diào)節(jié)作用， 但它的免疫調(diào)節(jié)機制目前尚不清楚。本實驗證明RTP、 APS均可抑制Mφ吞噬ManFITCBSA，提示RTP、 APS的免疫調(diào)節(jié)作用可能通過MR介導。

許多中藥多糖富含甘露糖或葡萄糖， 且以反復串聯(lián)的結(jié)構(gòu)存在， 與MR具有比MRmAb更高的結(jié)合特性［10］。如殼寡糖可通過Mφ表面的MR， 產(chǎn)生白介素1β和TNFα［11］; 海帶多糖能激活小鼠腹腔Mφ， 對S180腫瘤細胞有較好的殺傷作用［12］。我們的研究表明RTP含有近50%的甘露糖， 而APS則含有N乙酰葡糖胺殘基， 因此， RTP、 APS具有潛在的MR結(jié)合特性。我們的實驗結(jié)果表明， RTP與APS均可以阻斷MR介導的Mφ吞噬作用， 且這種作用呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系， 為兩種多糖作用于MR提供了依據(jù)。

為了進一步研究兩種多糖與MR的作用， 我們發(fā)現(xiàn)RTP和APS均可以促進Mφ分泌細胞因子TNFα， 而MR的拮抗劑甘露糖可完全阻斷RTP刺激Mφ分泌TNFα的作用， 說明RTP是通過MR而起作用; 甘露糖則沒有該作用; RTP和APS對Mφ分泌細胞因子IL4無明顯影響， 揭示RTP和APS影響Mφ的免疫功能主要通過Th1型細胞免疫發(fā)揮作用， 同時提示我們以前實驗中RTP和APS影響T細胞極化可能通過MR起作用。

參考文獻

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［10］Schepetkin IA， Quinn MT. Botanical polysaccharides: macrophage immunomodulation and therapeutic potential［J］. Int Immunopharmacol， 2006， 6(3): 317-333.

第9篇：巨噬細胞范文

【摘要】

目的: 分析連翹(FS )對小鼠腹腔巨噬細胞的體外吞噬和體外NO釋放的影響。方法: 無菌收集小鼠腹腔巨噬細胞和羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(CFDASE)標記大腸桿菌DH5α， 短期培養(yǎng)3 h后流式細胞術(shù)(FCM)分析FS對腹腔巨噬細胞體外吞噬的影響。用LPS體外刺激活化腹腔巨噬細胞， Griess Reagent試劑盒檢測并分析FS對巨噬細胞體外釋放NO的影響。結(jié)果: FCM分析顯示， 終濃度為40、 80、 160 mg/L的FS對小鼠腹腔巨噬細胞體外吞噬具有明顯的促進作用(P

【關(guān)鍵詞】 連翹提取物 腹腔巨噬細胞 吞噬 NO釋放

［Abstract］ AIM: To investigate the effect of forsythia suspensa (FS) extract on phagocytosis of peritoneal macrophages and NO production in vitro. METHODS: The peritoneal macrophagess were isolated from BALB/c mice. After stained with CFDASE， the DH5α were cocultured with peritoneal macrophagess for 3 h. The effect of FS extract on cytophagocytesis in vitro was analyzed by flow cytometry. The peritoneal macrophages were stimulated and activated by LPS in vitro. The effect of FS extract on NO production of the peritoneal macrophages in vitro was measured by NO assay kit. RESULTS: FCM analysis showed that FS extract significantly promoted the phagocytosis of peritoneal macrophages at the final concentration of 40， 80， 160 mg/L， respectively (P

［Keywords］forsythia suspensa extract;peritoneal macrophages;phagocytosis; NO production

連翹(forsythia suspensa， FS)又名旱蓮子、 大翹子、 落翹等， 為木犀科植物連翹的果實。它作為傳統(tǒng)中藥廣泛應(yīng)用于對炎癥、

發(fā)熱和潰瘍等方面的治療［1］。同時， FS的主要活性成分連翹苷在抗氧化、 抗菌、 抗病毒和解熱抗炎等方面［2］也起著重要的作用。本研究我們通過檢測FS對小鼠腹腔內(nèi)巨噬細胞體外吞噬和NO釋放的影響， 進一步研究其免疫學效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 材料 清潔級BALB/c近交系小鼠(雄性， 8～10周齡， 體質(zhì)量20～22 g)購自廣東省實驗動物中心。FS購自四川廣汗市維康植化有限公司。L谷氨酰胺、 β巰基乙醇、 刀豆蛋白A(concanavalin A， ConA)購自Sigma公司。羧基熒光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester， CFDASE)購自美國Molecular Probes 公司。RPMI1640、 胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)為美國GibcoBRL公司產(chǎn)品。Griess Reagent試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品。流式細胞儀(FACSCalibur)為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細胞的制備和細胞培養(yǎng) 斷頸處死小鼠， 用750 mL/L乙醇消毒， 腹腔注射RPMI1640完全培養(yǎng)液約5 mL。用棉球輕揉腹壁1～2 min后， 收集腹腔液， 1500 r/min離心10 min， 棄上清， 用RPMI1640完全培養(yǎng)液(含100 mL/L的FBS)調(diào)整細胞密度為2×109/L。根據(jù)需要接種于24孔(1mL/孔) 或96孔(0.2mL/孔)細胞培養(yǎng)板中， 37℃、 50mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h 。輕輕吸棄培養(yǎng)液后， 再用RPMI1640完全培養(yǎng)液洗去未貼壁細胞， 繼續(xù)培養(yǎng)［3］。

1.2.2 對大腸桿菌DH5α的染色標記 采用CFDASE染色標記大腸桿菌DH5α。CFDASE用二甲基亞砜(DMSO)溶解成10 mmol/L的儲存液， -20℃ 保存。臨用前， 取適量用PBS稀釋成1 mmol/L的工作液， 備用。新鮮大腸桿菌DH5α離心棄去LB培養(yǎng)基(4 000 g， 6 min)， 冷PBS洗滌1次， 調(diào)整細菌密度為1×1010/L， 加入CFDASE工作液(終濃度為8 μmol/L)， 充分混勻后在37℃搖床振蕩(220 r/min， 15 min)。RPMI1640培養(yǎng)基靜置10 min終止染色后離心， 經(jīng)RPMI1640洗滌2次(4000 g， 6 min)后， 重懸。流式細胞術(shù)(FCM)檢測DH5α的CFDASE染色標記率為90%。

1.2.3 巨噬細胞體外吞噬 將CFDASE標記好的大腸桿菌DH5α(1×107/孔)與小鼠腹腔巨噬細胞(細胞密度為2×109/L)一同接種到24孔板內(nèi)。實驗分組及處理: 設(shè)2組空白對照(RPMI1640完全培養(yǎng)液組和PBS組)和不同終質(zhì)量濃度FS組: (RPMI1640+FS 40)、 (RPMI1640+FS 80)、 (RPMI1640+FS 160)、 (PBS+FS 40)、 (PBS+FS 80)、 (PBS+FS 160)接種于24孔培養(yǎng)板。每組各設(shè)6個重復孔。37℃、 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中溫育3 h后， 用細胞刮輕輕刮下貼壁的巨噬細胞， 各組分別經(jīng)由70 μm濾器過濾， 立即以FCM檢測。

1.2.4 巨噬細胞體外NO釋放 實驗分組及處理， 設(shè)陰性對照組(單獨RPMI1640完全培養(yǎng)液組)、 陽性對照組(單獨LPS組)、 不同終質(zhì)量濃度的單純FS組和(FS+LPS)組， 每組設(shè)6個復孔， 接種于96孔培養(yǎng)板。給藥組細胞與藥物FS共孵育4 h后， 再加入LPS(終濃度為10 mg/L)刺激繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集相應(yīng)培養(yǎng)上清-20℃保存。采用Griess Reagent試劑盒(Promega)以檢測小鼠巨噬細胞培養(yǎng)上清中的NO穩(wěn)定氧化代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽(NO-2)水平， 間接反映NO的釋放量。50 mL小鼠巨噬細胞培養(yǎng)上清加入96孔平底酶標板中， 按試劑盒操作說明加入試劑， 室溫避光孵育10 min， 檢測A540值。

1.2.5 FCM檢測及分析 所有樣品經(jīng)FACSCalibur流式細胞儀和CELLQuest軟件獲取。先在前散射(FSC)對側(cè)散射(SSC)二維散點圖中， 劃出巨噬細胞細胞區(qū)R1。CFDASE為熒光1(FL1)。M1表示腹腔巨噬細胞吞噬經(jīng)CFDASE標記后DH5α百分率。全部數(shù)據(jù)經(jīng)FACSCalibur流式細胞儀和CellQuest軟件獲取， 每管樣品檢測10000個細胞， 獲得的數(shù)據(jù)用CellQuest軟件分析。統(tǒng)計學分析用統(tǒng)計軟件包SPSS10.0進行處理， 數(shù)據(jù)以x±s表示， 多組間比較采用方差分析， 兩兩間比較用LSDt檢驗。

2 結(jié)果

2.1 FS對腹腔巨噬細胞體外吞噬的影響 表1結(jié)果顯示， 僅對照組RPMI1640完全培養(yǎng)液和PBS組之間比較， 發(fā)現(xiàn)RPMI1640 懸浮的巨噬細胞吞噬率比對照組PBS表現(xiàn)較高。對照組RPMI1640 完全培養(yǎng)液和(RPMI1640+FS)組比較， 各濃度FS組均可促進巨噬細胞吞噬率的增加， 具有統(tǒng)計學意義。對照組PBS和(PBS+FS)組比較， 相同濃度FS組也可促進巨噬細胞吞噬率的增加， 具有統(tǒng)計學意義。不同濃度FS間比較有一定的濃度梯度依賴性。巨噬細胞體外吞噬的一次代表性實驗結(jié)果(圖1)。

表1 FS對腹腔巨噬細胞體外吞噬影響（略）

Tab 1 Influence of FS on the phagocytosis of peritoneal macrophage in vitro

aP

圖1 腹腔巨噬細胞體外吞噬DH5α（略）

Fig 1 Phagocytosis of peritoneal macrophage on DH5α in vitro

2.2 FS對腹腔巨噬細胞體外NO釋放的影響 表2結(jié)果顯示， 單純RPMI1640完全培養(yǎng)液組為陰性對照組。不同終質(zhì)量濃度的單純FS組均可抑制巨噬細胞體外NO釋放， 且隨著藥物濃度的升高其抑制NO釋放的程度越高， 具有統(tǒng)計學意義。LPS組為陽性對照組， 它的NO釋放結(jié)果為(0.36±0.01) μmol/L。在(LPS+FS)組中， FS也可抑制LPS誘導刺激巨噬細胞體外NO釋放， 不同濃度間也隨著藥物濃度的升高其抑制NO釋放的程度越高， 具有統(tǒng)計學意義。與單純FS組作用趨勢呈一致性。巨噬細胞體外吞噬的統(tǒng)計學實驗結(jié)果見圖2。

圖2 FS對腹腔巨噬細胞體外NO釋放影響（略）

Fig 2 Influence of FS on NO production of peritoneal macrophage in vitro

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表2 FS對腹腔巨噬細胞體外NO釋放影響（略）

Tab 2 Influence of FS on NO production of peritoneal macrophage in vitro

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3 討論

腹腔中的巨噬細胞主要是通過引起和調(diào)節(jié)局部細胞介導的免疫反應(yīng)來調(diào)節(jié)和維持腹腔環(huán)境的穩(wěn)定， 是一種十分重要的免疫輔助細胞。它在細胞膜上表達MHCI/II類分子和多種黏附分子以及IgG Fc受體(FcγR)、 C3b受體(CRI)和多種細胞因子受體。在與多種病原微生物識別與結(jié)合過程中， 可以高表達IA抗原和分泌較高水平L10， 通過受體與病原體等抗原異物結(jié)合經(jīng)吞噬或吞飲作用， 主動吞噬、 殺傷和消化病原微生物等抗原性物質(zhì)。

本實驗我們采用新的方法， 用CFDASE標記DH5α在體外被小鼠腹腔巨噬細胞吞噬， 間接證實了FS可促進小鼠腹腔巨噬細胞的體外吞噬。不同濃度的FS對其吞噬影響呈一定的梯度表現(xiàn)， 與對照相比均有統(tǒng)計學意義。我們推測FS可能通過與腹腔巨噬細胞表面的受體間的特異性結(jié)合而促進了巨噬細胞的吞噬功能; 或者也可能對作為抗原的大腸桿菌DH5α的受體Fc段存在一定的調(diào)理作用， 從而協(xié)同促進了腹腔巨噬細胞識別、 結(jié)合并吞噬的過程。

腹腔巨噬細胞的NO釋放是由LPS協(xié)同INFγ、 TNFα等細胞因子作用刺激誘導誘導型一氧化氮合酶(iNOS)所達成的［4］。我們已知NO作為體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)， 可以兼具細胞間、 細胞內(nèi)信使以及神經(jīng)遞質(zhì)作用的信號分子。它是由血管及機體許多其他組織類型的細胞合成， 以自分泌或旁分泌作用參與正常生理過程和某些疾病的發(fā)生發(fā)展， 如血管擴張、 血管通透性、 血小板黏附和聚集、 神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導、 宿主防御反應(yīng)等等。此外， 在免疫學上NO也具有重要的意義。它作為機體非特異性免疫系統(tǒng)的組成部分之一， 起著免疫效應(yīng)分子和免疫調(diào)節(jié)劑的作用， 可以殺傷細菌、 病毒和腫瘤細胞。但是， NO過量可對宿主細胞產(chǎn)生細胞毒性作用， 損害宿主細胞活性和導致基因突變， 如NO過量可誘發(fā)腫瘤， 有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與血液NO的濃度可呈正相關(guān)［5］。此外， 臨床上NO過量還常表現(xiàn)在的休克和哮喘等［6］。

已知LPS誘導激活巨噬細胞一般是沿2條道路進行啟動信號轉(zhuǎn)導途徑: 一是LPS與靶細胞膜相應(yīng)受體作用并啟動胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑; 二是LPS作用細胞后， 核內(nèi)基因表達的變化及其上游信號分子的確定［6］。研究表明LPS的刺激可激活或增強通路MAPK家族(ERK1/2， JNK1/2以及p38MAPK)的磷酸化， 同時還可促進巨噬細胞分泌釋放PGE2使之與其細胞表面G蛋白偶聯(lián)的受體結(jié)合激活腺苷酸環(huán)化酶， 導致cAMP 釋放增加及PKA的活化［7］。本試驗結(jié)果表明FS對LPS刺激小鼠腹腔巨噬細胞體外NO釋放有抑制作用。低濃度FS(40 mg/L)即可抑制腹腔巨噬細胞NO的體外釋放， 且各濃度梯度FS與對照組比較均有統(tǒng)計學意義。由此我們推測FS抑制小鼠腹腔巨噬細胞體外釋放NO的原因在于FS可能參與和影響了LPS誘導的某些通路的表達。文獻表明FS可以抑制cAMP磷酸二酯酶的活性并在一定程度上能夠降低胞內(nèi)cAMP的含量［8］; 它還可以抑制p38MAPK的活化、 阻斷NFκB途徑作用以及抑制iNOS蛋白和mRNA的表達［9］， 這些均為FS抑制腹腔巨噬細胞體外釋放NO提供了理論依據(jù)。

參考文獻

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