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【摘要】 目的 構(gòu)建一種能預(yù)防Asia Ⅰ型口蹄疫病毒（FMDV）的感染表位重組蛋白疫苗，并對(duì)其免疫學(xué)活性進(jìn)行研究。方法 以Asia Ⅰ型FMDV VP1上的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位氨基酸序列為抗原位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了包含上述位點(diǎn)的、具有最佳空間構(gòu)象的重組蛋白，命名為“CZ1”。通過(guò)PCR及基因克隆等方法構(gòu)建了其表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)鎳親和層析和G25凝膠過(guò)濾層析純化及復(fù)性，獲得具有免疫學(xué)活性的重組蛋白CZ1。免疫豚鼠獲得含針對(duì)AsiaⅠ型FMDV中和抗體的血清，通過(guò)細(xì)胞中和試驗(yàn)及乳鼠中和試驗(yàn)，檢測(cè)豚鼠血清中抗FMDV的保護(hù)性中和抗體滴度。結(jié)果 該基因工程重組蛋白能夠在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗AsiaⅠ型FDMV具有保護(hù)性的中和性抗體。結(jié)論 該基因工程重組蛋白有望開(kāi)發(fā)成預(yù)防AsiaⅠ型FDMV感染的新型疫苗。
【關(guān)鍵詞】 基因工程疫苗；FDMV；重組蛋白；活性檢測(cè)
口蹄疫（FMD）是由FMD病毒（FMDV）引起的一種人和動(dòng)物共患的急性發(fā)熱性高度接觸性的傳染病〔1〕。傳統(tǒng)FMD疫苗為弱毒疫苗或滅活疫苗，雖具有良好的免疫原性，但由于存在著滅活不徹底以及防護(hù)不當(dāng)，而致病毒擴(kuò)散傳播的危險(xiǎn)，這些不安全因素促使人們尋求新型的疫苗。有研究證明，T和B細(xì)胞抗原原位串聯(lián)連接構(gòu)建而成的基因工程疫苗能引起有效的機(jī)體免疫應(yīng)答，有利于具有保護(hù)性的中和抗體的產(chǎn)生〔2〕。本研究以Asia Ⅰ型FMDV VP1上的B和T細(xì)胞表位氨基酸序列為抗原位點(diǎn)，采用計(jì)算機(jī)軟件篩選出最佳的表位組合形式，擬利用基因工程方法構(gòu)建、表達(dá)包含上述位點(diǎn)的氨基酸序列的重組蛋白，以探索一種新型的AsiaⅠ型FMDV基因工程疫苗。
1 材料與方法
1.1 菌種、質(zhì)粒、引物、試劑、動(dòng)物及FMD滅活疫苗
JM109菌種、BL21(DE3)菌種、質(zhì)粒pMD18T和pET28a(+)均由本室保存。引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、dNTP、T4連接酶均購(gòu)自TAKARA公司。IPTG購(gòu)自Promega。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或試劑純。層析介質(zhì)NiSepharose 4B、G25 Superdex 購(gòu)自Healthcare GE。牛AsiaⅠFMD滅活疫苗購(gòu)自內(nèi)蒙古生物藥品廠。豚鼠購(gòu)自長(zhǎng)春高新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心。
1.2 重組質(zhì)粒pET28aCZ1的構(gòu)建及鑒定
結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，選取Asia Ⅰ型VP1上的B和T細(xì)胞表位的氨基酸序列，結(jié)合計(jì)算機(jī)空間構(gòu)象模擬篩選出多個(gè)T、B細(xì)胞表位串聯(lián)形式的重組蛋白。用PCR法構(gòu)建表位的基因序列，將其與pMD18T連接后，構(gòu)建串聯(lián)的重復(fù)序列；采用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，將基因片段亞克隆至經(jīng)同樣雙酶切的pET28a（+）質(zhì)粒上，構(gòu)建成含目的基因片段的pET28aCZ1重組質(zhì)粒；送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。
1.3 CZ1重組蛋白疫苗的表達(dá)
將重組質(zhì)粒pET28aCZ1轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)表達(dá)菌中，經(jīng)LB平板篩選后，挑取單克隆接種至LB培養(yǎng)液，于37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液A600=0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，37℃、220 r/min振蕩誘導(dǎo)、培養(yǎng)3 h，離心收集細(xì)菌。取誘導(dǎo)前后樣品進(jìn)行SDSPAGE鑒定。
1.4 CZ1蛋白的純化
取10 g濕菌與裂菌液（含8 mol/L尿素）按1∶5(M/V)重懸后，4℃、攪拌4 h。10 000 r/min離心15 min，取上清加載至預(yù)先平衡的NiSepharose 4B層析柱中。用含4 mol/L尿素的洗滌液洗滌至A280到基線后，洗滌液中尿素濃度降至3 mol/L，洗滌1 h后，尿素濃度降至1 mol/L洗滌3 h后，洗脫CZ1蛋白；收集目的蛋白后，加載到預(yù)先平衡的G25 Superdex層析柱中，收集CZ1蛋白。將每步驟留取的樣品進(jìn)行SDSPAGE鑒定。
1.5 豚鼠免疫
取3只體重為300 g左右豚鼠，股內(nèi)側(cè)肌肉注射CZ1蛋白質(zhì)（200 μg/只），同時(shí)設(shè)立PBS對(duì)照和AsiaⅠ型FMDV滅活疫苗陽(yáng)性對(duì)照。免疫后第21天采集血清。
1.6 中和試驗(yàn)
①96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中加50 μl/孔的細(xì)胞維持液，再加入50 μl/孔倍比稀釋的免疫后21 d的豚鼠血清，最后加入50 μl/孔200 TCID50稀釋的病毒，CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后，加入BHK21細(xì)胞，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，萘黑藍(lán)染色，Karber法計(jì)算血清中和抗體滴度。②取滅活補(bǔ)體的免疫21 d后的豚鼠血清分別按1∶32、1∶64、1∶128、1∶256稀釋，病毒用維持液稀釋至200 TCID50/100 μl，將病毒稀釋液和各稀釋度的血清等量混合后，37 ℃水浴1 h，乳鼠背部注射，100 μl/只，每份血清的每個(gè)稀釋度注射4只二日齡乳鼠，觀察并記錄注射后68 h每組乳鼠的存活情況，并以Karber法計(jì)算保護(hù)性中和抗體的滴度。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行兩組間方差檢驗(yàn)。
2 結(jié) 果
2.1 重組蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)
通過(guò)DNA star軟件及Expasy網(wǎng)站，對(duì)表位的多種構(gòu)建方式進(jìn)行蛋白質(zhì)的二及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，篩選出一種能模擬天然構(gòu)象的表位組合形式，其空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，其RGD序列（如箭頭所示）充分暴露在細(xì)胞表面，可能有利于中和性抗體的產(chǎn)生。后續(xù)實(shí)驗(yàn)按照這種表位組合形式構(gòu)建并表達(dá)目的蛋白，并命名為“CZ1”。
2.2 pET28aCZ1重組質(zhì)粒的構(gòu)建
通過(guò)PCR法合成目的基因經(jīng)TA連接后，將其亞克隆至原核表達(dá)載pET28a，獲得重組質(zhì)粒pET28aCZ1。pET28aCZ1 經(jīng)EcoR I和Hind Ⅲ雙酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，與預(yù)期相符（預(yù)期為945 bp），見(jiàn)圖2。DNA測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相符。
2.3 CZ1蛋白的表達(dá)及純化
將重組質(zhì)粒pET28aCZ1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)菌后，接種至LB培養(yǎng)基中，待細(xì)菌生長(zhǎng)至A600=0.6時(shí)，加入IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h。SDSPAGE分析顯示，目的蛋白質(zhì)分子量約為42 kD，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符，表達(dá)產(chǎn)量約占菌體總蛋白的50%左右。經(jīng)誘導(dǎo)后的菌體，以8 mol/L 尿素裂解包涵體，上清經(jīng)鎳親和層析和G25凝膠過(guò)濾層析純化，得到純度達(dá)到90% 的重組蛋白CZ1。見(jiàn)圖3。
2.4 FMDV細(xì)胞中和試驗(yàn)
觀察在牛Asia Ⅰ型FMDV活病毒的攻擊下，CZ1蛋白免疫的豚鼠血清能否中和該病毒對(duì)BHK21細(xì)胞的感染。若該血清中含有針對(duì)牛AsiaⅠ型FDMV的中和抗體，則可中和FMDV對(duì)BHK21細(xì)胞的感染而使其存活。結(jié)果顯示，免疫后第21天的3份豚鼠血清中和抗體滴度的幾何均數(shù)為286，滅活病毒組為320，與PBS組（≤3）比較差異顯著(P
2.5 中和試驗(yàn)
觀察在活的Asia Ⅰ型FMDV的攻擊下，CZ1蛋白免疫的豚鼠血清能否保護(hù)乳鼠抵抗該病毒的攻擊。將PBS組和CZ1蛋白免疫的各3份豚鼠血清分別按1∶32、1∶64、1∶128、1∶256稀釋，分別與FMDV孵育1 h后，注射4只乳鼠。如豚鼠血清中含有針對(duì)AsiaⅠ型FMDV的中和抗體，則乳鼠存活。結(jié)果顯示，CZ1重組蛋白免疫的3份豚鼠血清中，針對(duì)Asia I型FMDV的中和抗體滴度分別為1∶90、1∶256和1∶90，幾何均數(shù)為1∶127，與PBS組比較差異顯著(P
3 討 論
FMDV共有 A、O、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2、SAT 3等7個(gè)血清型，血清型之間沒(méi)有交叉免疫〔3〕；在我國(guó)，F(xiàn)MD疫情主要以O(shè)型、A型、AsiaⅠ三個(gè)血清型為主。2005 年初，我國(guó)江蘇、山東等省相繼暴發(fā)了AsiaⅠ型FMD，感染動(dòng)物以牛為主，波及我國(guó)大多數(shù)省區(qū)〔4〕?；蚬こ桃呙缬捎诎踩行Аr(jià)廉、易于大規(guī)模生產(chǎn)等，成為新型疫苗研究的熱點(diǎn)。
在本研究中，根據(jù)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定三級(jí)結(jié)構(gòu)從而決定蛋白質(zhì)功能的原理，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬空間構(gòu)象的方法篩選最適的基因序列，這種方法大大節(jié)省了時(shí)間、節(jié)約了成本。在設(shè)計(jì)時(shí)，考慮我國(guó)及周邊國(guó)家AsiaⅠ型 FMDV 流行株VP1 基因的抗原位點(diǎn)，以 FMDV VP1 的B和T細(xì)胞表位串聯(lián)的方式，成功地構(gòu)建了由6個(gè)表位組成的重組蛋白。選用大腸埃希氏菌作為表達(dá)系統(tǒng)，并考慮了大腸桿菌密碼子的偏愛(ài)性，對(duì)部分基因序列進(jìn)行了同義突變，以便提高多表位基因在大腸桿菌中的表達(dá)效率〔5，6〕，極大提高了重組蛋白CZ1的表達(dá)量，約占菌體總蛋白的50%。雖然pET表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的蛋白產(chǎn)物帶有6個(gè)His標(biāo)簽，易于純化，但大腸埃希氏菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白缺少諸如糖基化和磷酸化之類的翻譯后修飾作用，常形成包涵體，不利于表達(dá)產(chǎn)物的純化回收，且對(duì)獲得有生物學(xué)活性的表達(dá)產(chǎn)物造成極大的困難。重組蛋白CZ1為包涵體表達(dá)，本室采用了在NiSepharose層析純化的同時(shí)，通過(guò)逐步降低洗滌緩沖液中的尿素濃度，使重組蛋白CZ1復(fù)性，實(shí)現(xiàn)了重組蛋白質(zhì)純化和復(fù)性同時(shí)進(jìn)行，極大簡(jiǎn)化了工藝。
本試驗(yàn)結(jié)果表明，該重組蛋白疫苗能夠誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生具有針對(duì)Asia Ⅰ型FMDV的保護(hù)性中和抗體，可以中和該病毒對(duì)BHK21細(xì)胞的感染，且能夠保護(hù)乳鼠抵抗同型活病毒的攻擊，原因可能是由于重組蛋白CZ1能形成類似于天然FMDV VP1蛋白的三維構(gòu)象。以上結(jié)果表明，該重組蛋白具有保護(hù)牛抵抗Asia Ⅰ型 FMDV 的潛能，有可能開(kāi)被發(fā)成為Asia Ⅰ型FMD基因工程疫苗。
致謝：感謝內(nèi)蒙古金宇生物公司實(shí)驗(yàn)中心協(xié)助完成細(xì)胞中和試驗(yàn)和乳鼠保護(hù)試驗(yàn)。
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人胎球蛋白A （Fetuin-A）即α2-HeremansSchmid glycoprotein（AHSG） 胎球蛋白A于1944年由Pederson發(fā)現(xiàn)，是一種59kD的糖蛋白，是cystatin超家族（半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族）的一員，由兩個(gè)cystatin樣決定區(qū)和一個(gè)小的無(wú)關(guān)決定區(qū)組成［1］。AHSG具有多種生物學(xué)功能：與骨重塑、胎腦發(fā)育密切相關(guān)，并能維持體外細(xì)胞生長(zhǎng)；在腫瘤細(xì)胞表面，AHSG結(jié)合MMPs，可能涉及到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。AHSG主要在肝臟合成，含有兩個(gè)肽鏈結(jié)構(gòu)糖蛋白。在腦皮質(zhì)和骨骼骨髓也有人AHSG的分布。研究表明，AHSG在血液循環(huán)中可形成可溶性的AHSG鈣磷酸復(fù)合物，是體內(nèi)最強(qiáng)大的抑制軟組織鈣化作用的蛋白質(zhì)，因此慢性腎病患者非常高的組織或心血管組織鈣化的發(fā)生率與此有關(guān)。此外，AHSG可以用來(lái)觀察代謝綜合征血管鈣化、腎臟移植后軟組織的鈣化、血管和心臟瓣膜的鈣化、動(dòng)脈粥樣硬化等的生物學(xué)指標(biāo)。本文就AHSG在鈣化、炎癥及胰島素抵抗中的病理作用作一綜述。
1 胎球蛋白A與異位鈣化
目前，國(guó)際上對(duì)慢性腎病患者的血管鈣化有較深入的研究，引起血管鈣化的原因主要與磷、甲狀旁腺素相關(guān)肽、維生素D、骨調(diào)節(jié)蛋白及脂質(zhì)紊亂等相關(guān)［2］。但體內(nèi)也存在一些鈣化抑制物，充分利用鈣化抑制物，可減慢尿毒癥病人的血管鈣化的速率，AHSG就是近年發(fā)現(xiàn)的主要的系統(tǒng)鈣化抑制物。AHSG廣泛大量地存在于細(xì)胞外液，是一重要的循環(huán)鈣化抑制劑，在血液中能與基質(zhì)G1a蛋白（MGP）和鈣、磷形成復(fù)合體［3］，抑制磷灰石前體礦物質(zhì)的形成和沉積，占抑制血清鈣磷沉積作用的50％［4］，AHSG是屬于胎球蛋白族的血漿糖蛋白，主要由肝細(xì)胞合成和分泌，隨后進(jìn)入循環(huán)，聚集于骨骼中，在血液和腦脊液中含量都比較高，在鈣化的骨質(zhì)中濃度最大。AHSG分子的氨基末端存在與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）受體相似的序列，可與TGF-β結(jié)合，抑制依賴其的成骨細(xì)胞增生。TGF-β由骨基質(zhì)釋放的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，在骨形成過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用。ASHG的N端富含酸性氨基酸殘基，是堿性磷酸鈣（BCP）的結(jié)合位點(diǎn)，可與Ca2+、PO43-形成可溶性的無(wú)定形膠體微球，抑制血清過(guò)飽和的鈣磷鹽沉積［5］。
AHSG是一種體循環(huán)內(nèi)的系統(tǒng)鈣化抑制物，胎球蛋白的減少可引起異位鈣化，包括軟組織鈣化和血管鈣化，抑制鈣化的作用機(jī)制可能是通過(guò)與基質(zhì)Gla蛋白（MGP）、鈣、磷形成復(fù)合物，抑制磷灰石前體的形成和沉淀有關(guān)，而不影響骨骼礦化。血管鈣化在老年病人，特別是腎功能衰竭的透析病人中大量存在，已有臨床證據(jù)顯示ESRD患者血AHSG水平降低，而且低AHSG水平與心血管死亡率、全因死亡率相關(guān)［6］。Coen等應(yīng)用CT對(duì)血液透析患者進(jìn)行了冠狀動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈鈣化的檢測(cè)，同樣發(fā)現(xiàn)血AHSG水平與冠狀動(dòng)脈鈣化積分和腹主動(dòng)脈鈣化面積相關(guān)［7］。Jahnet-Dechent等發(fā)現(xiàn)AHSG敲除的老鼠發(fā)生嚴(yán)重的軟組織鈣化和血管鈣化［4］。近來(lái)在腎功能衰竭病人中發(fā)現(xiàn)AHSG明顯減少的病人血管鈣化和軟組織鈣化的發(fā)生率明顯增加，從而心血管疾病發(fā)病率也明顯提高。Kettleler等［8］通過(guò)對(duì)312例透析病人研究發(fā)現(xiàn)，透析病人血清胎球蛋白A水平明顯低于對(duì)照組，最近的一項(xiàng)研究顯示低的胎球蛋白A是一個(gè)與營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的因素，隨著腎臟替代治療的進(jìn)行，胎球蛋白A水平進(jìn)一步下降。這種下降與病人的血磷和鈣磷乘積相關(guān)，但與血鈣水平無(wú)關(guān)。Cozzolino等［9］研究認(rèn)為透析病人與正常人有相似的AHSG基因多樣性分布，但血清胎球蛋白A減少。透析病人的胎球蛋白A的減少原因認(rèn)為透析病人營(yíng)養(yǎng)不良發(fā)生率較高，身體抵抗力下降，長(zhǎng)期存在一些慢性炎癥有一定的關(guān)系，當(dāng)然透析病人的血管鈣化還與鈣磷代謝、甲狀旁腺功能亢進(jìn)有關(guān)。
2 胎球蛋白A與炎癥
研究認(rèn)為胎球蛋白也是一種負(fù)性炎癥急性相蛋白［10］，感染性疾?。〝⊙Y、肺炎、腦膜炎、外傷等）的患者在急性炎癥階段血清胎球蛋白A水平明顯下降，而在炎癥控制后其水平升至正常［11］。其原因可能是由于在炎癥狀態(tài)下，肝臟對(duì)其合成受損，溶菌酶及其他蛋白水解酶對(duì)其的降解增加有關(guān)。高水平胎球蛋白A可抑制TGF－α的產(chǎn)生，具有對(duì)抗炎癥的作用［12］。胎球蛋白參與巨噬細(xì)胞滅活，提高細(xì)胞攝取陽(yáng)離子能力以減輕炎癥因子如TGF－α、L－1β和L－6對(duì)細(xì)胞的損害［13］。近來(lái)一些研究認(rèn)為胎球蛋白不僅是急性炎癥階段明顯下降，透析病人慢性炎癥及慢性重癥肝炎也是明顯下降的，張磐等［14］證實(shí)了慢性重型肝炎病人胎球蛋白A水平明顯下降，認(rèn)為急性肝衰竭時(shí)，大量的肝細(xì)胞凋亡或壞死，胎球蛋白A合成減少，在抑制TNF－α 過(guò)程中被大量消耗和TNF－α通過(guò)抑制mRNA轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制胎球蛋白A的分泌有關(guān)。因此，胎球蛋白A可作為體內(nèi)反映炎癥狀態(tài)的標(biāo)志物。
3 胎球蛋白A與胰島素抵抗
胎球蛋白A不但具有促異位鈣化，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，而且具有抑制胰島素受體的酪氨酸酶活性作用［15］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該蛋白兼有抑制胰島素活性的作用［16］。Mori等發(fā)現(xiàn)，降低血清胎球蛋白A是吡格列酮改善胰島素抵抗的可能機(jī)制之一［17］，體內(nèi)缺乏胎球蛋白A增加病人對(duì)胰島素的敏感性。肥胖是代謝綜合征的重要組成成分，腹部脂肪過(guò)多與重要的代謝異常有關(guān)，如胰島素抵抗、高胰島素血癥、高甘油三酯血癥、高血壓病、糖耐量受損和糖尿病等。Norbert等［18］通過(guò)對(duì)47例無(wú)糖尿病的健康白種人進(jìn)行縱向分析，發(fā)現(xiàn)體重減輕后，肝臟脂肪的下降，隨之伴有胎球蛋白A水平的降低。動(dòng)脈實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，胎球蛋白A基因敲除的鼠在喂高脂飲食后，體重并不增加，血脂也明顯下降［16］，說(shuō)明胎球蛋白A與肥胖有明顯相關(guān)。高水平胎球蛋白A與罹發(fā)代謝綜合征風(fēng)險(xiǎn)增大和所有致動(dòng)脈粥樣硬化脂質(zhì)譜異常皆明顯獨(dú)立相關(guān)［19］。因此它是冠狀動(dòng)脈病的危險(xiǎn)因素之一。
綜上所述，胎球蛋白A是體液中存在的系統(tǒng)性鈣化抑制物，它的缺乏引起組織鈣化，透析病人中存在血液胎球蛋白A明顯下降的現(xiàn)象，透析病人異位鈣化發(fā)生率也遠(yuǎn)高于正常人，但透析病人引起胎球蛋白A下降的機(jī)制并不清楚，能否通過(guò)胎球蛋白A作為治療靶點(diǎn)，減少透析病人的異位鈣化是今后研究探索的方向。血液胎球蛋白A水平增高與代謝綜合征相關(guān)，致罹發(fā)MS風(fēng)險(xiǎn)增大。另外，胎球蛋白A作為體內(nèi)炎癥標(biāo)志物指導(dǎo)臨床治療有一定的意義。
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【關(guān)鍵詞】 小牛血清去蛋白；阿魏酸鈉；高壓氧；急性一氧化碳中毒
[Abstract] Objective Discuss the treatment effect of deproteinized calf bloodserum，sodium ferulate and high pressure oxygen on acute carbon monoxide poisoning. Methods Seventy-five cases with coma acute carbon monoxide poisoning were randomly pided into two groups: the treated group (37) and the control group(38). The two groups were treated with high pressure oxygen，high flow oxygen uptake and support treatment，The treated group were treated with deproteinized calf bloodserum and sodium ferulate . The control group were treated with Bao’erlindanjian act medicaments. Results The occurrence and injury degree of myocardial damage and delayed encephalopathy were markedly attenuated（P
[Keywords] deproteinized calf bloodserum; sodium ferulate; high pressure oxygen; acute carbon monoxide poisoning
急性一氧化碳（CO）中毒患者經(jīng)搶救在急性中毒癥狀恢復(fù)后易發(fā)生遲發(fā)性腦病，近年來(lái)遲發(fā)性腦病及其嚴(yán)重的后遺癥已引起高度重視。自2008 年10 月我們對(duì)收治的中、重度急性CO中毒37 例患者應(yīng)用阿魏酸鈉、小牛血清去蛋白聯(lián)合高壓氧治療，收到較好的臨床效果。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
在有昏迷史的75 例急性CO中毒住院病人中，隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組。治療組37 例，男16 例，女21 例，年齡14～80 歲，平均年齡47 歲；對(duì)照組38例，男18 例，女20 例，年齡13～82 隨，平均47.5 歲。2 組性別、年齡、既往史、中毒程度無(wú)顯著差異性（P>0.05）。
1.2 治療方法
2 組均在確診后生命體征平穩(wěn)的情況下即行高壓氧治療，急性期每天2 次，恢復(fù)期每天1 次，療程15～30 次，同時(shí)給高流量氧氣吸入3～5 天及對(duì)癥支持治療。治療組應(yīng)用阿魏酸鈉300 mg入5%葡萄糖250 ml中靜脈滴入，小牛血清去蛋白1.2 g入5%葡萄糖250 ml中靜脈滴入，連用14 天。對(duì)照組應(yīng)用胞二磷膽堿等藥物。
1.3 觀察指標(biāo)
入院后第1、3、5 天靜脈查心肌酶譜及心電圖，觀察心肌損傷的發(fā)生率及其嚴(yán)重程度，記錄神智轉(zhuǎn)清的時(shí)間，出院后2 個(gè)月內(nèi)電話隨訪病人了解遲發(fā)性腦病發(fā)生的情況。
1.4 診斷標(biāo)準(zhǔn)
有明確CO氣體接觸史，均有昏迷過(guò)程，除外其他疾病導(dǎo)致的昏迷，碳氧血紅蛋白均大于50%；心肌損傷的診斷標(biāo)準(zhǔn)及評(píng)分按2008 年1 月北京市科委重大項(xiàng)目“多器官功能障礙綜合征/降低病死率研究”課題組發(fā)表的《多器官功能中障礙綜合征（MODS）診斷標(biāo)準(zhǔn)、病情嚴(yán)重程度評(píng)分及預(yù)后評(píng)估系統(tǒng)和中西醫(yī)結(jié)合證型診斷》標(biāo)準(zhǔn)[1]。
1.5 統(tǒng)計(jì)方法
計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用兩樣本t檢驗(yàn)分析，P
2 結(jié)果
2.1 2 組心肌損傷的發(fā)生率及其嚴(yán)重程度評(píng)分
見(jiàn)表1。
表1 2組心肌損傷的發(fā)生率及嚴(yán)重程度評(píng)分比較
組別例數(shù)（n）心肌損傷（n）嚴(yán)重程度評(píng)分(n)
1分2分3分
治療組3716*（43.2）114*1
對(duì)照組3825*（63.1）714*4
與對(duì)照組比較P*
2.2 2組昏迷時(shí)間遲發(fā)性腦病發(fā)生率及死亡率比較
見(jiàn)表2。
表2 2組昏迷時(shí)間、遲發(fā)性腦病發(fā)生率及死亡率比較
組別例數(shù)（n）昏迷時(shí)間（h）遲發(fā)性腦病（n）死亡（n）
治療組374.62±2.46**1*（2.7）1（2.7）
對(duì)照組387.25±3.319*（23.6）2（5.2）
與對(duì)照組比較P*
3 討論
急性一氧化碳中毒導(dǎo)致腦缺氧后，腦血管隨即麻痹擴(kuò)張，腦容積增大，腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞ATP很快耗盡，鈉泵不能運(yùn)轉(zhuǎn)，納離子積累過(guò)多，導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞內(nèi)水腫而血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，造成腦血液循環(huán)障礙，進(jìn)一步加劇腦組織缺血缺氧，導(dǎo)致昏迷，經(jīng)搶救在急性中毒癥狀恢復(fù)后經(jīng)過(guò)數(shù)天或數(shù)周表現(xiàn)正常或接近正常的“假愈期”后，再次出現(xiàn)以急性癡呆為主的神經(jīng)精神癥狀和錐體外系癥狀的腦功能障礙。其機(jī)理：①微栓子學(xué)說(shuō)：急性中毒后缺氧致血管內(nèi)皮細(xì)胞遭受損害，內(nèi)膜粗糙引起血小板聚集形成微栓子，使白質(zhì)彌散缺氧缺血致脫髓鞘改變，②自由基學(xué)說(shuō)：缺氧后新供氧時(shí)產(chǎn)生大量自由基(類似缺血再灌注)，自由基所誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)神經(jīng)纖維髓造成損害。由于腦組織對(duì)缺氧的耐受能力最差，最先受累的是腦組織其次是心肌。與本研究結(jié)果相似：心肌損傷的發(fā)生率54.7%。
阿魏酸鈉是從當(dāng)歸川芎中提取的有效單體成分，其化學(xué)名3—甲基—4羧基桂皮酸鈉鹽2 水化合物，阿魏酸鈉能擴(kuò)張心腦血管，增加組織血液灌流量，改善微循環(huán)，減少組織細(xì)胞的缺血缺缺氧，促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)及再生。阿魏酸鈉已被證實(shí)能直接捕獲氧自由基，其分子結(jié)構(gòu)中的酚羥基具有消除自由基的功能。許多研究表明， 阿魏酸鈉對(duì)羥自由基和過(guò)氧化氫有直接清除作用，可減少超氧自由基和H2O2引起的膜脂質(zhì)過(guò)氧化，降低MDA的生成，是一種很強(qiáng)的天然抗氧化劑[2]。小牛血清去蛋白注射液，由多種游離氨基酸、小分子肽和寡糖等成分制成，能夠提高局灶性腦缺血大鼠腦血管的化學(xué)儲(chǔ)備能力[3]，對(duì)缺氧引起腦細(xì)胞損傷可改善腦細(xì)胞能量代謝，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)氧的攝取，保護(hù)在缺氧狀態(tài)下的腦神經(jīng)細(xì)胞[4]。其藥理作用有：①作用于神經(jīng)細(xì)胞膜上的葡萄糖載體，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)氧和葡萄糖的攝取；②促進(jìn)線粒體合成ATP，改善缺血狀態(tài)下細(xì)胞對(duì)氧的利用，活化細(xì)胞；③轉(zhuǎn)變細(xì)胞的無(wú)氧糖酵解為有氧糖代謝，延長(zhǎng)細(xì)胞在缺血缺氧狀態(tài)下生存的時(shí)間，增加組織細(xì)胞的抵抗力；④可以抑制缺血瀑布中的重要介質(zhì)一氧化氮的合成，從而全方位阻斷缺血瀑布反應(yīng)；⑤小分子激活肽能夠阻斷并修復(fù)損傷的神經(jīng)細(xì)胞[5]。
本研究顯示中、重度急性CO中毒后應(yīng)用小牛血清去蛋白、阿魏酸鈉聯(lián)合高壓氧治療，治療組較對(duì)照組心肌損傷的發(fā)生率及嚴(yán)重程度評(píng)分顯著降低（p
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