細(xì)胞核的功能精選(九篇)

前言：一篇好文章的誕生，需要你不斷地搜集資料、整理思路，本站小編為你收集了豐富的細(xì)胞核的功能主題范文，僅供參考，歡迎閱讀并收藏。

第1篇：細(xì)胞核的功能范文

[關(guān)鍵詞] 組蛋白去乙?；?吸煙;慢性阻塞性肺病

[中圖分類(lèi)號(hào)] R563[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1673-7210(2009)07(c)-016-04

Relationship between HDAC activity and lung function as well as smoking in peripheral blood mononuclear cells of COPD patients

CHEN Yanwei1, YANG Jiong2

(1.Department of Pulmonary Medicine, Shenzhen Nanshan Hospital of Guangdong Medical College, Shenzhen518052, China; 2.Department of Pulmonary Medicine, People's Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China)

[Abstract] Objective: To investigate the histone deacetylase (HDAC) activity in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of COPD patients, and determine the relationship between HDAC activity in PBMC and lung function as well assmoking quantity in COPD patients. Methods: COPD patients, healthy smokers and healthy nonsmokers were selected in our study. The peripheral blood of all subjects were obtained, and PBMC was separated via density gradient centrifugation. Histone was extracted and HDAC activity was detected. The lung function, smoking information of all subjects were recorded. Results: HDAC activity in PBMC from COPD patients was decreased by 40% compared with normal nonsmokers [(12.86±6.14) μmol/(L?μg) and (21.39±4.92) μmol/(L?μg), P=0.000)], this decrease showed statistical significance in stage 1, 2 and 3. HDAC activity in PBMC from healthy smoker was 40% lower than healthy nonsmokers [(12.50±4.27) μmol/(L?μg) and (21.39±4.92) μmol/(L?μg), P=0.000]. HDAC activity in PBMC from COPD was negatively correlated with smoking quantity (r=-0.867, P=0.000 for COPD patients; r=-0.607, P=0.000 for all subjects). In COPD patients who smoked more than 35 pack years and smoked less than 35 pack years, the HDAC activity in PBMC of the former decreased more than a half than that of the later. Conclusion: Smoking is one of the important reasons causing the decrease of HDAC activity in PBMC of COPD patients. HDAC activity in PBMC of COPD patients shows zero correlation with lung function (FEV1, FEV1%, FVC, FVC% and FEV1/FVC), suggesting smoking may have different mechanisms on the local and whole damage of lung.

[Key words] Histone deacetylase; Smoking; Chronic obstructive pulmonary disease

肺部炎癥是引起慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)氣流受限(肺功能)的主要原因。有研究表明,肺部炎癥的標(biāo)志物(IL-8、IL-6、CRP等)與氣流受限(肺功能)程度呈正相關(guān)。COPD患者肺組織和肺泡巨噬細(xì)胞中的HDAC活性與氣流受限呈正相關(guān),HDAC活性越低,氣道炎癥越重,FEV1%越低[1]。HDAC活性降低源于吸煙引起的氧化應(yīng)激的損傷。吸煙可引起直接肺氧化應(yīng)激損傷,也可引起間接的系統(tǒng)性氧化應(yīng)激。

肺泡巨噬細(xì)胞由外周血單核細(xì)胞遷移至肺分化而來(lái)。因此,本研究假設(shè)外周血單核細(xì)胞中HDAC活性低于健康對(duì)照,并觀察外周血單核細(xì)胞中HDAC活性與COPD患者氣流受限(肺功能)的關(guān)系,同時(shí)觀察吸煙量與HDAC活性的關(guān)系,以觀察HDAC活性是否受吸煙量的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 受試者基本情況

收集在武漢大學(xué)人民醫(yī)院體檢及就診的穩(wěn)定期COPD患者。正常對(duì)照為健康志愿者。經(jīng)患者知情同意,抽取外周靜脈血20 ml,加少量肝素抗凝,在4 h內(nèi)進(jìn)行外周血細(xì)胞分離。

1.2 穩(wěn)定期COPD診斷及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

參照GOLD(2006修訂版)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組制訂的慢性阻塞性肺病診治指南(2002)。所有患者均除外心、腦血管、肝、腎疾病、糖尿病、腫瘤、風(fēng)濕、結(jié)締組織疾病,以及肺結(jié)核、支氣管擴(kuò)張、支氣管哮喘及肺纖維化患者。

1.3 肺功能測(cè)定

所有受試者均行肺功能測(cè)定,采用Vmax6200(American Sensormedics, Vmax 229 series,Yorba Linda,California)肺功能系統(tǒng)檢測(cè)FVC、FVC%、FEV1、FEV1%、FEV1/FVC,由同一熟練技師操作,以保證測(cè)試的一致性。每位被測(cè)試者肺功能測(cè)定前3 d內(nèi)未使用支氣管擴(kuò)張劑,2周內(nèi)未使用茶堿和激素。

測(cè)試方法:吸入200 μg葛蘭素后10 min,平靜正常呼吸,遂后充分吸氣至肺總量位,迅速用最大力呼氣,呼氣時(shí)間≥6 s,或時(shí)間-容量曲線(xiàn)顯示呼氣相平臺(tái)出現(xiàn)且超過(guò)2 s后,用最快速度用力吸氣至肺總量位。每個(gè)被測(cè)試者分別至少測(cè)定3次(一般最多不超過(guò)8次),每個(gè)被測(cè)試者最佳值與次佳值2次差異小于5% FVC或0.5 L)。

1.4 人外周血單核細(xì)胞分離

人外周血單核細(xì)胞分離用密度梯度離心法[2]。將靜脈血與Hank's buffered salt solution (HBSS)1×緩沖液1∶1混合后共40 ml,裝于50 ml試管中。將混合血與人淋巴細(xì)胞分離液(Lymphoprep,Norway,1.077 g/ml)以2∶1體積混合。配平后用TDL-40L高速水平離心機(jī)離心,2 000 r/min(1 100 g/min),30 min。吸取中間白色薄霧層于新管。加HBSS于每管,將吸取液與HBSS混勻,HBSS體積大于1倍吸取液體積。配平后1 100 r/min,離心8 min。棄上清,加入HBSS吹打,移入一新試管中離心1 000 r/min,8 min,棄上清。將剩余液體混勻,吸取少量于細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),并用臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活性。如果細(xì)胞總數(shù)大于1×107個(gè)/ml,活性大于95%,視為合格標(biāo)本;用1 ml槍頭吸取剩余液體于標(biāo)記Ep管中,-70℃凍存。 1.5 直接組蛋白提取

組蛋白提取用HCl和H2SO4 4℃過(guò)夜法[3]。裂解液[10 mmol/L Tris-HCl,pH 6.5,50 mmol/L亞硫酸氫鈉,1% Triton X-100, 10 mmol/L MgCl2,8.6%蔗糖,完全蛋白酶抑制劑混合物(羅氏分子生化公司),20 min,4℃];核沖洗緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl,13 mmol/L EDTA,pH 7.4)。

將細(xì)胞微離心5 min;用冰凍裂解緩沖液反復(fù)沖洗片狀沉淀物,直至浮于表面的物質(zhì)清除(每次離心7 500 g/min,5 min)。用核沖洗緩沖液沖洗核片狀沉淀物,并且用50 μl 0.2 mol/L HCl和0.2 mol/L H2SO4在蒸餾水中懸浮。4℃過(guò)夜提取細(xì)胞核,微離心剩余物質(zhì)10 min,用1 ml冰凍丙酮混合上清液,-20℃過(guò)夜。微離心樣本10 min,用丙酮沖洗,干燥,并用蒸餾水稀釋。含有組蛋白的上清液樣品用Bradford protein kit(Bio-Rad)定量。Bradford法(考馬斯亮藍(lán))測(cè)組蛋白濃度。

1.6 HDAC活性檢測(cè)

細(xì)胞核提取物HDAC活性檢測(cè)使用HDAC活性熒光分析試劑盒(Cayman,USA),嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用方差分析;相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析;P

2 結(jié)果

2.1 一般資料

COPD患者26例,均為吸煙者,其中,1期7例,2期8例,3期8例,4期3例;健康吸煙者10例;健康非吸煙者13例,所有受試者均為男性,其身高、體重等無(wú)顯著性差異(P>0.05)。COPD組與健康吸煙組吸煙量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。COPD組平均年齡高于健康吸煙組和健康非吸煙組(P0.05)。

2.2 COPD患者外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性

COPD患者外周血單核細(xì)胞總HDAC活性較健康非吸煙者低40%左右[(12.86±6.14) μmol/(L?μg)和(21.39±4.92) μmol/(L?μg),P=0.000];在1、2、3期達(dá)到顯著性差異(圖1);其活性與健康吸煙者比較,無(wú)顯著性差異[(12.86±6.14) μmol/(L?μg)和(12.50±4.27) μmol/(L?μg),P=0.864]。健康吸煙者外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性較健康非吸煙者低40%,與COPD患者比較,無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖1外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性比較

Fig. 1Comparison of HDAC activity of PBMC among subgroups

2.3 COPD患者外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性與肺通氣功能的關(guān)系

COPD患者外周血單核細(xì)胞中HDAC活性與肺通氣功能均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)(表1)。

表1 外周血單核細(xì)胞中HDAC活性與FVC、FEV1、FEV1/FVC的關(guān)系

Tab.1 Relationship between FVC, FEV1, FEV1/FVC

and HDAC activity of PBMC

2.4 吸煙受試者外周血單核細(xì)胞中HDAC活性與吸煙量的關(guān)系

外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性與吸煙量(包年)呈負(fù)相關(guān)(在COPD患者中,r=-0.867,P=0.000;在所有吸煙者中,r=-0.607,P=0.000)(圖2)。

圖2外周血單核細(xì)胞中HDAC活性與吸煙的關(guān)系

(A:COPD患者;B:所有吸煙者)

Fig. 2Relationship between HDAC activity in PBMC and

smoking quantity

(A: COPD patients; B: all subjects enrolled)

吸煙量超過(guò)35包年的COPD患者外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性平均值明顯低于吸煙量低于35包年者(圖3)。

圖3吸煙量對(duì)COPD患者外周血單核細(xì)胞

中HDAC活性平均值的影響

Fig. 3Effect of smoking quantity on mean HDAC

activity of PBMC in COPD

3 討論

研究結(jié)果顯示,COPD患者外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性低于健康非吸煙者,與健康吸煙者比較,無(wú)顯著性差異;COPD患者外周血單核細(xì)胞中HDAC活性的降低與COPD氣流受限(肺功能)無(wú)明顯相關(guān),與患者吸煙量呈負(fù)相關(guān),提示外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性降低可能是吸煙的直接作用。

穩(wěn)定期COPD患者外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性降低與相同吸煙量的非COPD吸煙者的下降相同,而且兩組研究對(duì)象隨吸煙量增加,HDAC的下降更為明顯,提示人外周血單核細(xì)胞中HDAC下降與吸煙密切相關(guān)。

吸煙也可以引起染色體重構(gòu)[4],影響NF-κB的表達(dá),促使炎癥基因表達(dá)[5]。吸煙時(shí)每噴煙霧中至少含有10種氧化分子[6],這些氧化分子可以產(chǎn)生氧化應(yīng)激(oxidative stress)。吸煙引起的氧化應(yīng)激使細(xì)胞核HDAC活性降低,同時(shí)可以明顯降低上皮細(xì)胞的HDAC2表達(dá)[7-8],使炎癥因子表達(dá)增加;這種氧激發(fā)可以被抗氧化物N-乙酰半胱氨酸所阻斷[9]。健康吸煙者肺泡巨噬細(xì)胞HDAC活性低于健康不吸煙者[10]。氧化應(yīng)激可以通過(guò)影響細(xì)胞核HDAC活性而影響炎癥基因的表達(dá)。體外研究顯示,氧化應(yīng)激可以明顯降低HDAC活性和上皮細(xì)胞HDAC2的表達(dá)[7]。

本研究通過(guò)提純單核細(xì)胞核HDAC并測(cè)定其活性,提示外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性與吸煙量呈負(fù)相關(guān)。因此,COPD患者外周血單核細(xì)胞HDAC活性降低可能系吸煙所致。

本研究顯示,COPD患者外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性降低與COPD氣流受限(肺功能)零相關(guān)。

肺功能是目前COPD分級(jí)的主要依據(jù),主要反映氣道的阻塞程度,并不能反映COPD的炎癥程度。Ito等[1]發(fā)現(xiàn)HDAC活性在COPD患者的支氣管組織和肺泡巨噬細(xì)胞中降低,這種降低與COPD氣流受限(FEV1、FEV1/FVC)呈正相關(guān)。而本研究并未發(fā)現(xiàn)外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性降低與COPD氣流受限(肺功能)相關(guān),其原因可能與吸煙對(duì)肺部和全身的損害不同有關(guān)。

吸煙的煙霧中含有眾多物質(zhì),可以引起直接和間接肺損害。有害成分可以直接影響HDAC的活性或破壞肺組織,引起肺組織的急性損害。只有部分物質(zhì)可以進(jìn)入血液(如氧自由基等)并長(zhǎng)期在血液中停留。這些物質(zhì)可以作用于單核細(xì)胞,通過(guò)抑制HDAC活性來(lái)促進(jìn)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。即使停止吸煙,炎癥基因的表達(dá)維持了這種慢性炎癥。炎癥基因的表達(dá)受促炎癥轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié),這些轉(zhuǎn)錄因子主導(dǎo)、放大并且維持了COPD的慢性炎癥反應(yīng)。肺部的局部急性炎癥與肺功能(氣流受限)呈正相關(guān)。而本研究顯示,在穩(wěn)定期COPD患者的外周血單核細(xì)胞中,HDAC活性與COPD肺功能(氣流受限)無(wú)關(guān),提示吸煙對(duì)肺部的直接損害與全身的間接損害可能源于不同的機(jī)制。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Ito K, Ito M, Elliott WM, et al. Decreased histone deacetylase activity in chronic obstructive pulmonary disease [J]. N Engl J Med,2005,352(19):1967-1976.

[2]Cosio BG, Mann B, Ito K, et al. Histone acetylase and deacetylase activity in alveolar macrophages and blood mononocytes in asthma[J]. Am J Respir Crit Care Med,2004,170(2):141-147.

[3]Ito K, Lim S, Caramori G, et al. A molecular mechanism of action of theophylline: induction of histone deacetylase activity to decrease inflammatory gene expression[J]. Proc Natl Acad Sci,2002,99(13):8921-8926.

[4]Moodie FM, Marwick JA, Anderson CS, et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappa B activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells [J]. Faseb J,2004,18(15):1897-1899.

[5]Nishikawa M, Kakemizu N, Ito T, et al. Superoxide mediates cigarette smoke-induced infiltration of neutrophils into the airways through nuclear factor-kappa B activation and IL-8 mRNA expression in guinea pigs in vivo [J]. Am J Respir Cell Mol Biol,1999,20(2):189-198.

[6]Yanbaeva DG, Dentener MA, Creutzberg EC, et al. Systemic effects of smoking [J]. Chest,2007,131(5):1557-1566.

[7]Ito K, Hanazawa T, Tomita K, et al. Oxidative stress reduces histone deacetylase 2 activity and enhances IL-8 gene expression: role of tyrosine nitration [J]. Biochem Biophys Res Commun,2004,315(1):240-245.

[8]Tomita K, Barnes PJ, Adcock IM. The effect of oxidative stress on histone acetylation and IL-8 release [J]. Biochem Biophys Res Commun,2003,301(2):572-577.

[9]Cosio BG, Jazrawi E, Ito K, et al. Cigarette smoke decreases steroid responsiveness in monocytes: the role of histone deacetylase [J]. Am J Respir Crit Care Med,2003,167:A804.

第2篇：細(xì)胞核的功能范文

【關(guān)鍵詞】 結(jié)核分枝桿菌; 抗原提呈; T細(xì)胞亞群; 流式細(xì)胞術(shù); 激光共聚焦顯微鏡

［Abstract］ AIM: To explore whether the human peripheral γδ T cells stimulated by polypeptide heat resistant antigen from Mycobacterium tuberculosis (MtbHAg) express phenotype and have the fuction of antigen presentation. METHODS: The monocytes isolated by adhesion method from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were cultured with GMCSF， IL4 and induced into the mature dendritic cells by adding LPS. PBMCs were stimulated with MtbHAg and IL2 to expand predominantally γδ T cells that were further purified by flow sorting. The pure T cells were isolated from PBMCs using adhesion revomal and nylon column method， labeled with CFSE， and cultured in alone with Mtb secretory antigen (MtbSAg)， in monocytes with MtbSAg， or with MtbSAg prepulsed dendritic cells or MtbHAg activated γδ T cells for 11 days. The proliferation of the CD4+T cells were measured by flowcytometry. The MtbHAg activated γδ T cells were incubated with FITC labelled MtbSAg for different time， and the ingestion of MtbSAg by γδ T cells was measured by flowcytometry and observed with laser confocal microscopye. RESULTS: The expressions of MHCII and costimulatory molecules CD80 and CD86 on γδ T cells that activated by MtbHAg marketly incrased in comparison with that on the resting γδ T cells. The expanded cell counts and proliferation index of the pure nave T cells that induced by MtbSAg pretreated activated γδ T cells were similar to that induced by mature DC. By using flowcytometer and laser confocal microscope， FITC labellaed MtbSAg was ingested by the activated γδ T cells. CONCLUSION: γδ T cells stimulated by polypeptide MtbHAg express the phenotype of professional antigenpresenting cells and they are able to present MtbSAg to nave T cells to induce the proliferation of CD4+T cells.

［Keywords］Mycobacterium tuberculosis; antigen presentation; T lymphocyte subpopulation; flow cytometry; laser confocal microscope

以往的研究表明機(jī)體在抗結(jié)核桿菌（Mycobacterium tuberculosis， Mtb）感染免疫中， 主要有αβ T細(xì)胞（CD4＋和CD8＋T細(xì)胞）和巨噬細(xì)胞發(fā)揮重要作用， 而近年的許多研究證明， γδ T細(xì)胞在抗Mtb感染中也起到重要的防御作用， 并可能通過(guò)與其他免疫細(xì)胞之間相互作用， 影響機(jī)體在抗Mtb感染中的免疫應(yīng)答過(guò)程。在健康人外周血中， γδ T細(xì)胞僅占T細(xì)胞庫(kù)的2%～10%， 根據(jù)其TCRδ鏈V區(qū)片段不同又可以分為Vδ1+和Vδ2+二種亞型， Vδ1+T細(xì)胞主要分布在黏膜上皮和皮膚組織， 而Vδ2+T細(xì)胞則主要分布在外周血中。已有研究發(fā)現(xiàn)Vδ2+T細(xì)胞能識(shí)別小分子的非肽類(lèi)抗原， 并在此類(lèi)抗原的刺激下產(chǎn)生顯著的擴(kuò)增［1， 2］。有研究發(fā)現(xiàn)， 從扁桃體分離的未活化的γδ T細(xì)胞用異戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate， IPP) 和來(lái)自大腸埃希菌的非肽類(lèi)抗原4羥基3甲基2烯基焦磷酸［(E)4hydroxy3methylbut2enyl pyrophosphate， HMBPP］刺激后， 表達(dá)協(xié)同刺激分子和MHCⅡ類(lèi)分子的能力與單核細(xì)胞來(lái)源的， 脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）刺激誘導(dǎo)成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell， DC）相似［3］。但以往的研究， 以及我們以前的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)來(lái)自結(jié)核桿菌的多肽類(lèi)耐熱抗原也可優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增人Vδ2+T細(xì)胞［4， 5］。本實(shí)驗(yàn)中， 我們用多肽類(lèi)Mtb耐熱抗原(Heat resistant antigen， MtbHAg)優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增人外周血中的γδ T（Vδ2+）細(xì)胞， 觀察活化后的γδ T細(xì)胞是否能表現(xiàn)出抗原提呈細(xì)胞的表型以及是否具有抗原提呈的功能， 探討γδ T細(xì)胞在抗Mtb感染的天然免疫和獲得性免疫中的橋聯(lián)作用。

1 材料和方法

1.1 材料 Mtb耐熱抗原(MtbHAg)和Mtb分泌性抗原(MtbSAg)由本實(shí)驗(yàn)室從培養(yǎng)的MtbH37Ra株制備獲得， 羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰胺酯(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester， CFSE) 購(gòu)自Molecular Probes公司; RPMI1640培養(yǎng)液(GIBCO公司) 補(bǔ)充L谷氨酰胺2 mmol/L、 二巰基乙醇(2ME)50 μmol/L、 丙酮酸鈉1 mmol/L、 慶大霉素50 mg/L和新生小牛血清(NBS， 杭州四季青公司) 100 mL/L后為完全RPMI1640培養(yǎng)液; 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate， FITC) 和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide， DMSO) 購(gòu)自Merk 公司; 熒光抗體小鼠抗人CD4PE、 小鼠抗人TCRγδPE、 小鼠抗人CD14FITC、 小鼠抗人HLADRPecy 5.5和小鼠抗人CD83FITC等購(gòu)自Caltag公司; 小鼠抗人CD80FITC和CD86FITC購(gòu)自eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 γδ T細(xì)胞的活化和分選純化 抽取健康志愿者外周血5～10 mL， 肝素抗凝， 用淋巴細(xì)胞分離液和梯度離心法常規(guī)分離獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood monouclear cells， PBMC）， 將PBMC用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L， 加入24孔板， 再加入Mtb耐熱抗原(MtbHAg) 2.5 mg/L， 置于37℃、 50 mL/L CO2中培養(yǎng)5 d后分孔培養(yǎng)， 每隔3 d加入rhIL2 5×104 U/L， 約9 d即可得到富含γδ T細(xì)胞的活化T細(xì)胞， 經(jīng)抗TCRPE染色后， 用PBS制備分選用細(xì)胞懸液(1×1010/L)， 在流式細(xì)胞儀FACSCalibur上進(jìn)行分選獲取純化的γδ T細(xì)胞。

1.2.2 DC的體外培養(yǎng)及檢測(cè) 常規(guī)方法分離獲取PBMC， 加入24孔板中， 細(xì)胞密度為每孔5×109/L， 37℃、 50 mL/L

CO2培養(yǎng)2 h后吸去懸浮細(xì)胞， 并用預(yù)熱的RPMI1640輕洗培養(yǎng)孔， 以去除殘留懸浮細(xì)胞， 即獲得貼壁細(xì)胞。補(bǔ)充培養(yǎng)液后加入rhGMCSF 100 μg/L， IL4 100 μg/L， 第3天時(shí)半量換液， 并再次添加GMCSF和IL4， 第6 天半量換液的同時(shí)再加入LPS 1 mg/L， 第8天收獲懸浮細(xì)胞， 分別用小鼠抗人CD83FITC， CD14FITC和HLADRPeCy5.5標(biāo)記后在流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單核細(xì)胞來(lái)源DC的成熟程度。

1.2.3 尼龍毛柱法分離純化T淋巴細(xì)胞 常規(guī)方法分離獲取PBMC， 調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L， 加入6孔板中， 2 mL/孔， 置于37℃、 50 mL/L CO2中培養(yǎng)2 h后， 吸出懸浮細(xì)胞， 調(diào)整細(xì)胞密度為1×1010/L， 注入已制備好的尼龍毛柱內(nèi)， 另加入5 mL的完全RPMI1640液， 密封， 37℃、 50 mL/L CO2中孵育1 h后， 用RPMI1640完全培養(yǎng)液沖洗毛柱， 收集沖洗出來(lái)的細(xì)胞， 即為純化T細(xì)胞（purified T， pu T)。

1.2.4 CFSE標(biāo)記pu T 將獲得的pu T調(diào)整細(xì)胞密度為5×109/L， 每毫升細(xì)胞懸液加入1 μL CFSE， 使其終濃度為2 μmol/L， 37℃染色10 min后取出用含100 mL/L NBS的完全RPMI1640培養(yǎng)液洗2次后將染色后pu T制成細(xì)胞懸液(1×109/L)。此即為CFSE標(biāo)記的pu T (pu TCFSE)。

1.2.5 FITC標(biāo)記MtbSAg 將MtbSAg(1 g/L) 1 mL加入已處理過(guò)的透析袋中， 扎緊袋口放入pH9.5碳酸鹽緩沖液透析過(guò)夜， 透析后取出， 加DMSO配制FITC溶液（1 g FITC/L）混合， 使FITC/MtbSAg的比例為50 μg∶1 mg。室溫避光在水平振蕩器上慢速振搖2 h后轉(zhuǎn)入透析袋中， 對(duì)200 mL PBS透析8 h后換液， 共3次。4℃避光保存。

1.2.6 四種不同的培養(yǎng)方法刺激αβ T細(xì)胞擴(kuò)增 CFSE標(biāo)記的pu T， 調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L， 加入24孔板培養(yǎng)， 每孔1 mL， 并按以下四種不同方法加入MtbSAg或抗原提呈細(xì)胞。a: CFSE標(biāo)記的pu T單獨(dú)培養(yǎng)， 同時(shí)加入MtbSAg 25 mg/L。b: CFSE標(biāo)記的pu T中加入單核細(xì)胞 (單核細(xì)胞: pu TCFSE為1∶100)， 加MtbSAg 25 mg/L。c: 體外培養(yǎng)的單核細(xì)胞來(lái)源的成熟DC(MDC)與終濃度25 mg/L 的MtbSAg孵育， 37℃ 2 h后， RPMI1640洗滌3次， 加入pu TCFSE (DC∶Pu TCFSE為1∶100) 中培養(yǎng)。d: 流式分選純化的MtbHAg活化γδT細(xì)胞與終濃度為25 mg/L的MtbSAg孵育， 37℃ 2 h后， RPMI1640洗滌3次， 加入到pu TCFSE(活化的γδT細(xì)胞: pu TCFSE為1∶100)中培養(yǎng)。上述4種細(xì)胞培養(yǎng)在第4天時(shí)加IL2 (5萬(wàn)U/L)擴(kuò)增細(xì)胞， 隔天半量換液并添加同量的IL2以維持細(xì)胞生長(zhǎng)。

1.2.7 FCM和激光共聚焦檢測(cè)活化γδ T細(xì)胞對(duì)FITC標(biāo)記MtbSAg的攝入 將MtbHAg活化的γδ T細(xì)胞的密度調(diào)整為1×1010/L， 取100 μL細(xì)胞懸液， 加FITC標(biāo)記的MtbSAg 10 μL， 抗TCRγδPE 3 μL， 避光 37℃， 水浴30 min 至120 min后， PBS洗滌3次， 盡量去除殘余液體， 加入10 g/L多聚甲醛200 μL 固定后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)FITC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)， 表示攝入MtbSAg細(xì)胞的比率。同時(shí)將水浴90 min的試管輕彈混勻后取出2 μL， 加少量甘油混合后滴在載玻片上， 加上蓋玻片后即在激光共聚顯微鏡（Nikon C1 Si）下觀察和拍攝記錄， 獲取的圖象文件用Freeviewer軟件分析顯示。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示， 數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。樣本均數(shù)的兩兩比較， 采用t檢驗(yàn)， P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血單核細(xì)胞來(lái)源DC的表型檢測(cè) PBMC來(lái)源的單核細(xì)胞經(jīng)GMCSF， IL4培養(yǎng)6 d后加入LPS誘導(dǎo)為成熟的DC后， 用FCM檢測(cè)其表型， 發(fā)現(xiàn)HLADR仍為高表達(dá)（81.89%)， 代表DC成熟的CD83與培養(yǎng)前低表達(dá)（7.83％）相比非常顯著地高表達(dá)(85.40%)， 而單核細(xì)胞的特征標(biāo)志CD14從培養(yǎng)前的87.2%降低到5.31%。

2.2 活化的γδT細(xì)胞表達(dá)協(xié)同刺激分子 檢測(cè)健康人外周血中靜止的γδ T細(xì)胞表面CD80、 CD86和HLADR的表達(dá)水平非常低， 分別為(1.37±2.36)%， (4.13±3.33)%和(8.84±5.44)%; 而經(jīng)MtbHAg活化后γδ T細(xì)胞CD80、 CD86和HLADR的表達(dá)分別增加到(62.33±7)%、 (89.12±3.5)%、 (80.56±7.29)% (圖1)。

2.3 不同培養(yǎng)方法對(duì)純化初始T細(xì)胞增殖總數(shù)的影響 在4種不同培養(yǎng)方案中， 加入的純化T細(xì)胞數(shù)均為1.0×106， 單獨(dú)加MtbSAg的a組， 和加單核細(xì)胞和MtbSAg的b組， 培養(yǎng)到第11天時(shí)， 細(xì)胞數(shù)分別為1.2×106和5.6×106。而純化T細(xì)胞加入預(yù)先與MtbSAg處理的DC（c組）和γδ T細(xì)胞（d組）， 培養(yǎng)11 d后的細(xì)胞數(shù)分別為7.79×106和8×106(圖2)。

2.4 FCM分析CD4+T細(xì)胞的增殖情況和Modfit軟件分析CD4+T細(xì)胞的增殖指數(shù) 用CFSE標(biāo)記的純化T細(xì)胞用4種方法培養(yǎng)到第11天時(shí)， 標(biāo)記CD4熒光mAb后用流式細(xì)胞儀測(cè)定和分析， 結(jié)果表明純化T細(xì)胞單獨(dú)加MtbSAg的a組， 增殖的CD4+T細(xì)胞僅占4.5%; 加單核細(xì)胞和MtbSAg的b組， 增殖的CD4+T細(xì)胞所占比例為35.4%， 而加入MtbSAg預(yù)處理的成熟DC和活化γδT細(xì)胞的c組和d組， 增殖的CD4+T細(xì)胞所占比例分別達(dá)到56.4%和57.1%（圖3A）。用Modfit軟件中的增殖分析模塊進(jìn)行分析， 得到CD4+T細(xì)胞各代細(xì)胞所占百分率， 增殖指數(shù)(Proliferation Index， PI， 即增殖后細(xì)胞總數(shù)與增殖前細(xì)胞總數(shù)的比值。在加入MtbSAg預(yù)處理的DC（c組）和活化γδT細(xì)胞（d組）， 培養(yǎng)第11天時(shí)CD4+T細(xì)胞的PI分別為58.9和51.9， 且增殖的代數(shù)主要集中在第9、 10代， 分別為75.93%和75.71%。加入單核細(xì)胞的b組CD4+T細(xì)胞的PI為24.39， 第9、 10代所占的比例為57.65%， 而僅有純化T細(xì)胞的a組中， CD4+T細(xì)胞的PI和第9、 10代所占的比例僅為4.5%和4.04%（圖3B）。

2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察活化的γδ T細(xì)胞攝入SAg MtbHAg刺激活化的γδ T細(xì)胞與FITC標(biāo)記的MtbSAg在37℃孵育90 min 時(shí)， 同時(shí)加入抗TCRγδ PE熒光抗體， 在激光共聚焦顯微鏡下觀察， 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜被染成紅色的γδ T細(xì)胞內(nèi)分布有大量呈綠色熒光（FITC）細(xì)小散點(diǎn)物質(zhì)(圖4)。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活化的γδ T細(xì)胞攝入MtbSAg MtbHAg激活的γδ T細(xì)胞與FITCMtbSAg在37℃孵育時(shí)， 加入抗TCRγδ PE熒光抗體， 用流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， MtbSAg攝入率即γδ T細(xì)胞中FITC+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷增加。在孵育30、 60和90 min時(shí)， 攝入率分別為(26.68±3.58)%、 (48.09±3.29)%和(53.32±3.29)%; 但是在120 min時(shí)降低至(31.28±5.80)% (圖5)。

3 討論

為了探討多肽類(lèi)抗原激活的人γδ T細(xì)胞是否也具有抗原提呈作用， 首先考慮是否有涉及抗原提呈細(xì)胞有關(guān)的表型分子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用多肽類(lèi)的MtbHAg作為優(yōu)勢(shì)激活γδ T細(xì)胞的抗原， 其中具有激活γδ T細(xì)胞效應(yīng)的主要組分是Mr在10 000～14 000的非分泌性耐熱多肽［4， 5］。用這種多肽抗原激活的γδ T細(xì)胞在培養(yǎng)增殖到第11天時(shí)， 其表面HLADR和協(xié)同刺激分子(CD80和CD86)從培養(yǎng)前的低表達(dá)（1％～8％）顯著上調(diào)為高表達(dá)（62％～89％）， 表明這些細(xì)胞已具有抗原提呈細(xì)胞的表型。

Brandes等［3］發(fā)現(xiàn)IPP活化γδ T細(xì)胞攝入可溶性抗原后與初始αβ T細(xì)胞共同培養(yǎng)促使細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)中純化T細(xì)胞（幾乎均是αβ T細(xì)胞）與MtbSAg摻入的DC培養(yǎng)11 d后數(shù)量增加7倍， 而與MtbSAg摻入的活化γδ T細(xì)胞共同培養(yǎng)后， αβ T細(xì)胞的數(shù)量增加8倍。我們進(jìn)一步用CFSE標(biāo)記初始純T淋巴細(xì)胞后， 再與MtbSAg摻入的DC或γδ T細(xì)胞培養(yǎng)， 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)后用Modfit軟件進(jìn)行分析CD4+T細(xì)胞各代細(xì)胞所占百分率， 發(fā)現(xiàn)由活化γδ T細(xì)胞和成熟DC作為抗原提呈細(xì)胞的二組， 培養(yǎng)到晚期時(shí)增殖的細(xì)胞絕大多數(shù)均是集中在第9、 10代。說(shuō)明引起CD4+T細(xì)胞增殖的能力幾乎相同。這些結(jié)果表明， 用MtbHAg活化的γδ T細(xì)胞和成熟DC一樣， 具有提呈可溶性抗原給初始T細(xì)胞， 引起CD4+T增殖的能力。這與 Brandes報(bào)道的用非肽類(lèi)抗原刺激的γδ T細(xì)胞提呈可溶性抗原的結(jié)果相一致。

為了證實(shí)MtbHAg活化的γδ T細(xì)胞能攝入蛋白抗原， 本實(shí)驗(yàn)將活化的γδ T細(xì)胞與FITC標(biāo)記的MtbSAg在37℃的條件下孵育， 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示γδ T細(xì)胞攝入SAg的能力隨著時(shí)間的增加而增加（30 min 至 90 min）。同時(shí)， 在激光共聚焦顯微鏡下也觀察到γδ T細(xì)胞能將抗原攝入胞內(nèi)。

綜上所述， 經(jīng)MtbHAg活化γδ T細(xì)胞具有抗原提呈作用， 其功能活性似乎與成熟DC沒(méi)有明顯差別， 但γδ T細(xì)胞更容易獲取和體外操作。因此， 這種活化的γδ T細(xì)胞可在制備疫苗和免疫治療中成為新的目標(biāo)［6］。

參考文獻(xiàn)

［1］ Hayday A， Theodoridis E， Ramsburg E， et al. Intraepithelial lymphocytes: exploring the third way in immunology［J］. Nat Immunol， 2001， 2(11): 997-1003.

［2］ Chen ZW， Letvin NL. Adaptive immune response of Vγ9Vδ2T cells: a new paradigm［J］. Trends Immunol， 2003， 24(4): 213-219.

［3］ Brandes M， Willimann K， Moser B. Professional antigenpresentation function by human γδ T cells［J］. Science， 2005， 309(5732): 264-268.

第3篇：細(xì)胞核的功能范文

【摘要】

目的: 本研究旨在探索紫杉醇、 順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡后能否具有較強(qiáng)的免疫原性， 并可以被抗原提呈細(xì)胞交叉提呈并促進(jìn)免疫應(yīng)答。方法: 用巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)和白介素4（IL4）刺激人外周血單核細(xì)胞分化誘導(dǎo)為樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）， 6 d后將DC和經(jīng)紫杉醇聯(lián)合順鉑在體外誘導(dǎo)發(fā)生凋亡的人卵巢癌細(xì)胞株共同培養(yǎng)， 并以?xún)鋈诩?xì)胞共培養(yǎng)DC組和單獨(dú)DC組作對(duì)照， 共培養(yǎng)4 h后， 進(jìn)行激光掃描共聚焦顯微鏡觀察DC細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬作用， 同時(shí)以流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)不同培養(yǎng)組DC的分化和成熟程度。結(jié)果: 紫杉醇、 順鉑誘導(dǎo)的凋亡卵巢癌細(xì)胞可被DC有效吞噬， 與對(duì)照組相比， 凋亡組DCs的表達(dá)及成熟度均明顯增高， 并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。結(jié)論: 紫杉醇、 順鉑誘導(dǎo)的凋亡卵巢癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的免疫原性， 可以促進(jìn)DC的分化和成熟。

【關(guān)鍵詞】 紫杉醇; 順鉑; 樹(shù)突狀細(xì)胞; 細(xì)胞凋亡; 抗原提呈

［Abstract］ AIM: To explore wheather apoptotic ovarian cancer cells induced by paclitaxelcisplatin could be crosspresented by antigen presenting cells and promote immune responses. METHODS: DCs were generated from peripheral blood monocytes in RPMI1640 supplemented with GMCSF and IL4. After 6 days’ incubation， DCs were further cocultured with either apoptotic HO8910 cell lines induced by paclitaxelcisplatin or control cells for four hours. Maturation of DCs was compared among different groups according to their surface markers through flow cytometry assay and their phagocytosis ability was evaluated by confocal microscopy scanning assay. RESULTS: Apoptotic ovarian cancer cells induced by paclitaxelcisplatincan were phagocytized more efficiently by DCs.Resulting is more cellularity and maturation of DCs in apoptotic cellinduced groups than control group(P

［Keywords］paclitaxel; cisplatin; dendritic cells; apoptotic cells; antigen presentation

化療藥物通過(guò)誘導(dǎo)凋亡來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞， 而凋亡的腫瘤細(xì)胞是否具有免疫原性一直是倍受爭(zhēng)議的話(huà)題， 近來(lái)研究表明化療藥物誘導(dǎo)的凋亡腫瘤細(xì)胞能否有效激發(fā)免疫應(yīng)答， 與腫瘤細(xì)胞的性質(zhì)和化療藥物有關(guān)［1］。本研究旨在探索紫杉醇聯(lián)合順鉑化療藥物誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡后的免疫原性， 探討誘導(dǎo)凋亡的腫瘤細(xì)胞能否被樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell， DC）交叉提呈， 從而促進(jìn)免疫應(yīng)答， 為臨床制定合理的化療聯(lián)合免疫療法治療腫瘤提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 紫杉醇、 順鉑購(gòu)自山東齊魯制藥廠; 淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海化學(xué)試劑廠; 巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor， GMCSF)、 白介素4（interleukin4， IL4）、 腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα， TNFα）均購(gòu)自R&D公司; CFSE(carboxyfluorescein succinimidylester)活細(xì)胞探針購(gòu)自Invitrogen公司; 小鼠抗人抗體CD14、 CD80、 CD83、 CD86、 CD1a單克隆抗體(mAb)購(gòu)自ebioscience公司; AnnexionⅤPI核酸染料購(gòu)自深圳晶美公司; RPMI1640培養(yǎng)液、 2.5 g/L胰酶、 胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）購(gòu)自Gibco公司; 人卵巢癌HO8910細(xì)胞株為上海市免疫學(xué)研究所饋贈(zèng); 人濃縮白細(xì)胞由自愿者提供。

1.2 方法

1.2.1 人外周血細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化和培養(yǎng)DC 取60 mL濃縮WBC， PBS稀釋至200 mL， 采用淋巴細(xì)胞分離液經(jīng)密度梯度離心分離獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞， PBS洗滌細(xì)胞2次， 細(xì)胞計(jì)數(shù)， 在6孔板中以無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞至密度為5×109/L， 置37℃、 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱2 h后取出， 洗去懸浮細(xì)胞（收集備用）， 加入含GMCSF(100 μg/L)、 IL4(50 μg/L)和100 mL/L FBS的RPMI1640培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞， 第3天半量換液， 第6天收集懸浮細(xì)胞， 計(jì)數(shù)。

1.2.2 HO8910凋亡細(xì)胞的制備 將HO8910細(xì)胞按紫杉醇和順鉑不同的作用劑量和不同時(shí)間分組處理， 紫杉醇順鉑濃度分別為2.5～0.3 mg/L、 25～3 mg/L、 125～15 mg/L、 250～30 mg/L， 分別作用12 h、 24 h和36 h后， 用2.5 g/L胰酶消化貼壁細(xì)胞， 將細(xì)胞用PBS重懸至1×109/L， 取100 μL， 以藥物未處理組為空白對(duì)照， 參照Annexin VPI試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

1.2.3 HO8910凍融抗原制備 收獲HO8910細(xì)胞， 用PBS重懸至2×1010/L， 置液氮內(nèi)10 min， 取出后速投入37℃水浴溶解， 反復(fù)5次。以3 000 r/min離心10 min， 收集上清， -80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 DC與凋亡細(xì)胞激光共聚焦掃描 消化對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期HO8910細(xì)胞株， 以PBS 重懸細(xì)胞至1×109/L， 加入CFSE終濃度為25 μmol/L， 50 mL/L CO2、 37℃培養(yǎng)箱共孵育30 min， RPMI1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次后， 用含100 mL/L胎牛血清（FBS）的RPMI1640液重懸細(xì)胞， 并鋪板培養(yǎng)。次日加入紫杉醇和順鉑（濃度為250～30 mg/L）， 培養(yǎng)24 h（此條件為1.2.2步驟實(shí)驗(yàn)得出誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的最佳濃度和時(shí)間）后取出， 收集懸浮細(xì)胞， 計(jì)數(shù)。凋亡細(xì)胞與培養(yǎng)6 d后的DC以1∶1比例共孵育， 以未處理細(xì)胞為對(duì)照， 按相同比例和DC共培養(yǎng)， 4 h后取出， 用PBS洗滌細(xì)胞， 加入小鼠抗人PECD83抗體， 共孵育30 min后， 用PBS洗滌細(xì)胞， 并用40 g/L多聚甲醛固定懸浮細(xì)胞， 置于細(xì)胞甩片機(jī)中1 000 r/min離心3 min， 將細(xì)胞固定于載玻片上， 500 mL/L甘油PBS封片， 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)。

1.2.5 不同類(lèi)型腫瘤抗原負(fù)載DC表面標(biāo)志的檢測(cè) DC培養(yǎng)至6 d， PBS沖洗收獲所有的DC， 分為3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn): 空白組， 單純DC組; 凍融組: HO8910凍融抗原負(fù)載DC組; 凋亡組: 紫杉醇順鉑誘導(dǎo)HO8910凋亡細(xì)胞負(fù)載DC組。共培養(yǎng)4 h后洗滌細(xì)胞， 用100 mL/L FBS1640懸浮細(xì)胞， 并加入TNFα至100 μg/L， 培養(yǎng)24 h后流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)DC細(xì)胞表面CD1a、 CD14、 CD80、 CD83、 CD86的表達(dá)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料以x±s表示， 采用SPSS11.5數(shù)據(jù)包方差分析， P

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇順鉑誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞株HO8910凋亡最佳時(shí)間與劑量的選擇 為確定紫杉醇和順鉑聯(lián)合誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞株HO8910的最佳作用劑量和最適作用時(shí)間， 我們選取了4個(gè)作用濃度和3個(gè)作用時(shí)間點(diǎn)（見(jiàn)前）處理HO8910細(xì)胞， 結(jié)果顯示紫杉醇順鉑作用濃度為125～15 mg/L， 作用時(shí)間12 h后細(xì)胞凋亡開(kāi)始明顯增加， 以250～30 mg/L濃度作用24 h細(xì)胞基本完全凋亡。顯微鏡下可見(jiàn)作用24 h后， 細(xì)胞呈懸浮狀， 部分細(xì)胞胞膜不完整。作用36 h后FCM檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞大多呈壞死狀態(tài)， 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈碎片。上述結(jié)果表明， 紫杉醇和順鉑聯(lián)合誘導(dǎo)HO8910細(xì)胞凋亡時(shí)， 濃度250～30 mg/L， 作用24 h為凋亡最適劑量、 最佳時(shí)間點(diǎn)效應(yīng)（圖1）。

圖1 紫杉醇/順鉑作用不同濃度與不同時(shí)間細(xì)胞的凋亡比例（略）

Fig 1 The percentage of apoptotic cells induced by Paclitaxel/Cisplatin at different concentrations and time points

a: 125 paclitaxel+15 mg/L cisplatin for 12 h; b: 250 paclitaxel+ 30 mg/L cisplatin for 24 h; c: 250 paclitaxel+30 mg/L cisplatin for 36 h.

2.2 外周血單核細(xì)胞來(lái)源的DC的體外誘導(dǎo) 經(jīng)常規(guī)貼壁法獲得外周血單核細(xì)胞后， 采用通用的GMCSF和IL4條件培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)分化DC， 培養(yǎng)3 d后， 在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞開(kāi)始呈集簇生長(zhǎng)， 部分細(xì)胞的細(xì)胞膜有突起， 培養(yǎng)至第6天， 可見(jiàn)大部分細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)， 胞體大且外形不規(guī)則， 細(xì)胞膜呈樹(shù)突狀突起， 胞質(zhì)豐富， 并具有典型DC形態(tài)（圖2）， 表明細(xì)胞已向DC分化， 可用于進(jìn)一步表型分析和功能檢測(cè)。

圖2 倒置顯微鏡下DC的形態(tài)特征（略）

Fig 2 The morphology of induced DC observed with inverted microscope(×400)

2.3 誘導(dǎo)DC細(xì)胞的表型檢測(cè) 外周血來(lái)源的單核細(xì)胞經(jīng)GMCSF和IL4誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d后， 獲得未成熟的DC細(xì)胞， 采用單獨(dú)TNFα作用、 TNFα﹢凍融細(xì)胞和TNFα﹢凋亡細(xì)胞培養(yǎng)24 h后， FCM檢測(cè)DC表面標(biāo)志的表達(dá)。結(jié)果顯示條件培養(yǎng)第6天較培養(yǎng)前CD14的表達(dá)明顯下降， CD1a、 CD80、 CD86的表達(dá)上調(diào)， CD83的表達(dá)為10%左右（圖3）。培養(yǎng)7 d后單獨(dú)TNFα作用和TNFα+凍融細(xì)胞作用后CD83表達(dá)約35%左右， 兩者間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 但其在TNFα﹢凋亡細(xì)胞作用后表達(dá)上升為50%， 且與前兩者間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

圖3 誘導(dǎo)前、 GMCSF/IL4、 GMCSF/IL4/TNFα誘導(dǎo)后細(xì)胞表面標(biāo)志變化（略）

Fig 3 Alteration of surface markers on preinduced monocytes， GMCSF/IL4 induced and GMCSF/IL4/TNFα induced DC cells

表1 不同腫瘤抗原刺激后DC表面標(biāo)志的表達(dá)（略）

Tab 1 Comparative analysis of surface markers on DC pulsed with different types of tumor antigens

aP

2.4 凋亡細(xì)胞可以被DC細(xì)胞有效的吞噬 比較DC與凋亡的HO8910細(xì)胞和未處理HO8910細(xì)胞共培養(yǎng)后， DC對(duì)兩類(lèi)細(xì)胞的吞噬情況， 結(jié)果顯示（圖4）僅在凋亡組中可見(jiàn)DC膜與凋亡細(xì)胞融合、 DC細(xì)胞胞體內(nèi)有凋亡小體、 小顆粒狀溶解碎片等一系列DC吞噬凋亡細(xì)胞的現(xiàn)象， 而DC對(duì)正常的HO8910無(wú)吞噬作用。進(jìn)一步通過(guò)FCM檢測(cè)DC吞噬凋亡細(xì)胞在時(shí)相上是否存在差異， 結(jié)果表明隨共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)， DC的吞噬未見(jiàn)增加， 4 h與24 h之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 DC對(duì)凋亡腫瘤細(xì)胞、 未處理的腫瘤細(xì)胞吞噬的激光共聚焦掃描（略）

Fig 4 Phagocytosis of dendritic cells against apoptotic and normal HO8910 cell lines

A: Apoptosis HO8910 cell lines; B: HO8910 cell lines.

3 討論

卵巢癌死亡率極高， 減少卵巢癌復(fù)發(fā)、 提高預(yù)后的一個(gè)重要策略是在手術(shù)和化療后再應(yīng)用如免疫治療、 分子靶向治療和基因治療等鞏固療法［2］。近年來(lái)研究表明化療藥物誘導(dǎo)的凋亡腫瘤細(xì)胞能夠有效激發(fā)免疫應(yīng)答［3］。如果能將卵巢癌免疫治療與傳統(tǒng)治療方法合理聯(lián)合將為卵巢癌的治療開(kāi)辟新的途徑、 帶來(lái)新的曙光。研究證明腫瘤免疫逃逸的機(jī)制不僅由于缺乏抗原， 而且與抗原不能被有效提呈給T細(xì)胞而不能產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答有關(guān)［4］。因此腫瘤免疫治療的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)是如何使抗原被有效提呈而激發(fā)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。如果化療誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞具有免疫原性、 能被APCs提呈則是化療聯(lián)合免疫治療的基礎(chǔ)。

Nowak等［5］學(xué)者發(fā)現(xiàn)二氟脫氧胞嘧啶核苷介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞不是耐受原， 凋亡細(xì)胞能誘導(dǎo)DC成熟并激活相關(guān)的T細(xì)胞。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)化療誘導(dǎo)的凋亡腫瘤細(xì)胞數(shù)目增加， 使得APCs吞噬作用加強(qiáng)， APCs被激活后釋放更多的前炎性細(xì)胞因子， 從而促進(jìn)APCs對(duì)腫瘤抗原的交叉提呈［6］。而Casares等［7］發(fā)現(xiàn)絲裂霉素C致凋亡的腫瘤細(xì)胞不具有免疫原性。上述研究結(jié)果提示， 不同腫瘤細(xì)胞經(jīng)不同化療藥物作用后， 其免疫原性仍然存在不確定性。紫杉醇和鉑類(lèi)是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的卵巢癌一線(xiàn)化療藥物， 本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用紫杉醇聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞株凋亡后， 論證凋亡細(xì)胞對(duì)DC的影響。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)與凋亡細(xì)胞共培養(yǎng)的DC胞內(nèi)見(jiàn)吞噬凋亡小體， 且DC胞體中出現(xiàn)小顆粒狀溶解碎片， 而DC對(duì)正常HO8910無(wú)吞噬作用。同時(shí)FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與凋亡細(xì)胞共培養(yǎng)的DC， 其共刺激分子表達(dá)較空白組和凍融組顯著升高， 因此相同數(shù)量凋亡腫瘤細(xì)胞的免疫原性強(qiáng)于凍融腫瘤抗原， 表明DC通過(guò)吞噬負(fù)載凋亡細(xì)胞后其成熟度的表達(dá)明顯增加， 行使抗原提呈的功能顯著增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明紫杉醇+順鉑誘導(dǎo)的凋亡卵巢癌細(xì)胞并不隔離抗原， 相反使交叉提呈的腫瘤抗原性顯著增加， 促進(jìn)了DC的成熟與提呈作用。

此外， 本研究中還有一個(gè)發(fā)現(xiàn)， 即凍融組在加凍融抗原前后， DC的共刺激分子表達(dá)無(wú)明顯改變， DC未被凍融抗原活化。我們認(rèn)為部分原因有可能是由于加入凍融抗原的效價(jià)過(guò)低， 但更可能是來(lái)源于HO8910的凍融腫瘤抗原本身不具有誘導(dǎo)異體DC活化的抗原表位， 但凋亡組加凋亡細(xì)胞后， DC的共刺激分子表達(dá)改變明顯。本研究認(rèn)為應(yīng)用凋亡的細(xì)胞作為抗原可能不需要識(shí)別腫瘤特異性肽段和受MHC限制， 化療誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞有望成為免疫治療的自身抗原， 這些對(duì)于DC疫苗的制備及化療聯(lián)合免疫治療提供了重要的信息。

腫瘤的免疫治療規(guī)范化是一個(gè)尚未解決的問(wèn)題， 如何將免疫治療與傳統(tǒng)的化療結(jié)合起來(lái)更是一個(gè)空白的領(lǐng)域。越來(lái)越多的研究認(rèn)為化療誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞促進(jìn)免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此如何將免疫治療與化療合理結(jié)合將是今后致力研究的課題， 本課題為此研究提供了重要理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］ Correale P， Cusi MG， Del Vecchio MT， et al. Dendritic cellmediated crosspresentation of antigens derived from colon carcinoma cells exposed to a highly cytotoxic multidrug regimen with gemcitabine， oxaliplatin， 5fluorouracil， and leucovorin， elicits a powerful human antigenspecific CTL response with antitumor activity in vitro［J］. J Immunol， 2005， 175(2): 820-828.

［2］ Coukos G， ConejoGarcia JR， Ronder RB， et al. Immunotherapy for gynaecological malignancies［J］. Expert Opin Biol Ther， 2005， 5(9): 1193-1210.

［3］ Vari F， Hart DN. Loading DCs with Ag［J］. Cytotherapy， 2004， 6(2): 111-121.

［4］ Ward S， Casey D， Labarthe MC， et al. Immunotherapeutic potential of whole tumor cells［J］. Cancer Immunol Immunother， 2002， 51(5): 351-357.

［5］ Nowak AK， Lake RA， Marzo AL， et al. Induction of tumor cell apoptosis in vivo increases tumor antigen crosspresentation， crosspriming rather than crosstolerizing host tumorspecific CD8 T cells［J］. J Immunol， 2003， 170(10): 4905-4913.

第4篇：細(xì)胞核的功能范文

關(guān)鍵詞：包裝設(shè)計(jì);實(shí)用功能;審美價(jià)值

中圖分類(lèi)號(hào)：J0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-291X（2014）31-0024-02

包裝設(shè)計(jì)是人類(lèi)文化活動(dòng)的重要組成部分，體現(xiàn)了人類(lèi)心智的積極、創(chuàng)造。在中國(guó)當(dāng)代包裝設(shè)計(jì)發(fā)展的實(shí)踐進(jìn)程中，尤其是在信息時(shí)代多元文化語(yǔ)境對(duì)中國(guó)包裝設(shè)計(jì)的圍合影響下，把握和堅(jiān)持包裝設(shè)計(jì)的文化性，挖掘、整理中國(guó)包裝設(shè)計(jì)中優(yōu)秀豐富的文化內(nèi)涵，將傳統(tǒng)的文化思想精髓同當(dāng)代設(shè)計(jì)的要素有機(jī)結(jié)合起來(lái)尤為重要。

一、功能的實(shí)用價(jià)值

商品的包裝強(qiáng)調(diào)對(duì)客戶(hù)需要的滿(mǎn)足，而產(chǎn)品正是滿(mǎn)足消費(fèi)者需要的組合體，而不單單是實(shí)體的組件。還包括消費(fèi)者對(duì)虛榮心的滿(mǎn)足、對(duì)名譽(yù)、威望的獲取以效用的增進(jìn)等等。良好的包裝能增加產(chǎn)品的功能、擴(kuò)大產(chǎn)品的效用，成為產(chǎn)品不可缺少的一部分。包裝設(shè)計(jì)，涉及到功能、材料和形式三個(gè)方面的因素。設(shè)計(jì)師的創(chuàng)造能力，都體現(xiàn)于對(duì)這三個(gè)要素的良好的處理之中。三個(gè)要素中，功能決定形式，功能是主導(dǎo)因素。商品包裝舉具有以下三個(gè)功能：

1.保護(hù)功能

保護(hù)功能是包裝最基本的功能，即使商品不受各種外力的損壞。一件商品，要經(jīng)多次流通，才能走進(jìn)商場(chǎng)或其他場(chǎng)所，最終到消費(fèi)者手中，這期間，需要經(jīng)過(guò)裝卸、運(yùn)輸、庫(kù)存、陳列、銷(xiāo)售等環(huán)節(jié)。在儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中，很多外因如撞擊、潮濕、光線(xiàn)、氣體、細(xì)菌等因素，都會(huì)威脅到商品的安全。因此，作為一個(gè)包裝設(shè)計(jì)師，在開(kāi)始設(shè)計(jì)之前，首先要想到包裝的結(jié)構(gòu)與材料，保證商品在流通過(guò)程中的安全。

2.便利功能

所謂便利功能，也就是商品的包裝是否便于使用、攜帶、存放等。一個(gè)好的包裝作品，應(yīng)該以“人”為本，站在消費(fèi)者的角度考慮，這樣會(huì)拉近商品與消費(fèi)者之間的關(guān)系，增加消費(fèi)者的購(gòu)買(mǎi)欲，對(duì)商品的信任度，也促進(jìn)消費(fèi)者與企業(yè)之間溝通。很多人購(gòu)買(mǎi)易拉罐裝的飲料時(shí)，都喜歡開(kāi)蓋時(shí)的那一聲“啪”帶來(lái)的。

3.銷(xiāo)售功能

人們常說(shuō)“酒香不怕巷子深”、“一等產(chǎn)品、二等包裝、三等價(jià)格”，只要產(chǎn)品質(zhì)量好，就不愁賣(mài)不出去。在市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)日益強(qiáng)烈的今天，營(yíng)銷(xiāo)推廣的作用與重要性也為廠商深諳。人們已感覺(jué)到“酒香也怕巷子深”。如何讓自己的產(chǎn)品得以暢銷(xiāo)，如何讓自己的產(chǎn)品從琳瑯滿(mǎn)目的貨架中跳出，只靠產(chǎn)品自身的質(zhì)量與媒體的轟炸，是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。

在各種超市與自選賣(mài)場(chǎng)如雨生春筍般而起的今天，最直接面向消費(fèi)者是產(chǎn)品自身的包裝。好的包裝，能直接吸引消費(fèi)者的視線(xiàn)，讓消費(fèi)者產(chǎn)生強(qiáng)烈的購(gòu)買(mǎi)欲，從而達(dá)到促銷(xiāo)的目的。

正如人們常說(shuō)的 “包裝是沉默的商品推銷(xiāo)員”。如今，很多聰明的廠商與廣告策劃公司，都把包裝列為企業(yè)的4P策略之一（Position市場(chǎng)、Product產(chǎn)品、Package包裝、Prices價(jià)格）。把包裝融入CI之中，在推銷(xiāo)產(chǎn)品的同時(shí)，也提升了自身的企業(yè)形象。

總之，功能的實(shí)用價(jià)值是包裝設(shè)計(jì)的最根本屬性，一旦失去了其實(shí)用價(jià)值，任何設(shè)計(jì)都失去了其存在的意義。

二、藝術(shù)的審美價(jià)值

1.包裝設(shè)計(jì)的綜合性

包裝涉及知識(shí)范圍很廣泛，對(duì)設(shè)計(jì)師而言現(xiàn)代社會(huì)的消費(fèi)是―個(gè)極富挑戰(zhàn)的境地，不能用舊的觀念來(lái)做現(xiàn)代的設(shè)計(jì)。因此，設(shè)計(jì)師除了天賦資質(zhì)之外，創(chuàng)造的關(guān)鍵是敏感，要對(duì)商品、商店、市場(chǎng)和其他流通環(huán)節(jié)的親身體驗(yàn)和科學(xué)的考察，并不斷接觸變化中的商業(yè)態(tài)勢(shì)，深入理解對(duì)產(chǎn)品的設(shè)計(jì)要求、設(shè)計(jì)定位，然后再依靠高度的創(chuàng)作沖動(dòng)，獲取設(shè)計(jì)靈感。全面的包裝設(shè)計(jì)，需對(duì)包裝裝飾與包裝結(jié)構(gòu)有所側(cè)重，跨出傳統(tǒng)的專(zhuān)業(yè)設(shè)計(jì)的范疇，同時(shí)兼?zhèn)涞纳鐣?huì)和科學(xué)職能所具有的較高的科技知識(shí)和文學(xué)修養(yǎng)所支配著，這樣才能運(yùn)籌帷幄、自如地解決好商品包裝的綜合表達(dá)能力。

在現(xiàn)代包裝設(shè)計(jì)上，我們提倡大膽創(chuàng)新，要適合現(xiàn)代人的不同層面的精神和情感等因素的需要，敢于冒險(xiǎn)而尋求新突破，注重個(gè)性體現(xiàn)不同類(lèi)別的商品設(shè)計(jì)，從多角度、多方面地創(chuàng)造出與內(nèi)容相適應(yīng)的現(xiàn)代包裝藝術(shù)形式，在技法上允許不同手法交互使用，在印刷上盡取不同工藝之所長(zhǎng)。因此，對(duì)于工藝制作的選擇是保證包裝藝術(shù)質(zhì)量的關(guān)鍵。包裝設(shè)計(jì)師不僅要意識(shí)到而且要準(zhǔn)確地、綜合和靈活地運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)，以使現(xiàn)代包裝設(shè)計(jì)藝術(shù)給人以豐富的聯(lián)想和美感，并且能具備可欣賞的、具有高品味、時(shí)代感和吸引力的整體形象的獨(dú)立性，從而讓人們?cè)谫?gòu)買(mǎi)商品時(shí)得到審美的美學(xué)價(jià)值。

2.包裝設(shè)計(jì)的獨(dú)特性

商品包裝要突出藝術(shù)個(gè)性。個(gè)性即矛盾的特殊性，人們對(duì)現(xiàn)實(shí)的審美意識(shí)具有無(wú)限豐富的多樣的個(gè)性差異，藝術(shù)的發(fā)展需要?jiǎng)?chuàng)造，而藝術(shù)創(chuàng)造的價(jià)值則寓于個(gè)性之中，每個(gè)藝術(shù)種類(lèi)的個(gè)性是它區(qū)別于其他藝術(shù)種類(lèi)的獨(dú)特本質(zhì)特點(diǎn)。包裝設(shè)計(jì)也是同樣，商品在流通時(shí)必須通過(guò)包裝來(lái)進(jìn)行區(qū)別。同類(lèi)的或不同類(lèi)的商品依靠其獨(dú)特的包裝設(shè)計(jì)來(lái)被消費(fèi)者識(shí)別認(rèn)定最終認(rèn)可而購(gòu)買(mǎi)。

包裝設(shè)計(jì)也要有強(qiáng)烈的視覺(jué)沖擊力。在琳瑯滿(mǎn)目的商品世界中，唯有亮麗的色彩，與眾不同的圖案造型，生動(dòng)地展現(xiàn)產(chǎn)品個(gè)性形象，才能使消費(fèi)者一見(jiàn)鐘情。

現(xiàn)代設(shè)計(jì)講求破除規(guī)矩、平板的格式，講究富于創(chuàng)造性的、生氣勃勃的審美感已成為一種潮流，以往煩瑣綺麗的風(fēng)格已被現(xiàn)代設(shè)計(jì)中簡(jiǎn)潔、大方、明快的格調(diào)所取代，給人們?cè)诿β档纳钪械靡苑潘?，從而吸引消費(fèi)者的注意，給消費(fèi)者以審美愉悅，激發(fā)購(gòu)買(mǎi)欲，所有這些正是包裝設(shè)計(jì)的獨(dú)特性所帶來(lái)的效應(yīng)。

利用包裝設(shè)計(jì)的獨(dú)特性開(kāi)拓市場(chǎng)之路、引領(lǐng)市場(chǎng)消費(fèi)作用不可低估，大有文章可做。

3.包裝設(shè)計(jì)的欣賞性

任何成功的藝術(shù)都富有美的價(jià)值，而美的藝術(shù)必須服務(wù)于現(xiàn)實(shí)生活，因?yàn)槊恳粋€(gè)藝術(shù)作品的產(chǎn)生都包括藝術(shù)取材、美的想象和表達(dá)，這是客觀表現(xiàn)與藝術(shù)內(nèi)容構(gòu)成的需要。包裝設(shè)計(jì)的藝術(shù)特點(diǎn)就是要表現(xiàn)內(nèi)在的本質(zhì)，而美必須符合實(shí)用、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確，迅速傳遞商品信息的原則。現(xiàn)代包裝在設(shè)計(jì)上更關(guān)注情感，關(guān)注家庭，營(yíng)造生產(chǎn)氛圍，這已成為現(xiàn)代包裝設(shè)計(jì)審美特性的一項(xiàng)重要內(nèi)容。總體來(lái)看，這一系列包裝，注重實(shí)用與審美的統(tǒng)一，設(shè)計(jì)上更多關(guān)注是美學(xué)價(jià)值的含量，即在統(tǒng)一中求變化，在變化中又有一種完善的整體感，呈現(xiàn)出雅致而高貴的宣染力和優(yōu)美而深沉的歷史文化感。這種變化不僅是人類(lèi)的富足表現(xiàn)，也是提高人類(lèi)精神需要的表現(xiàn)，包裝所體現(xiàn)的民族風(fēng)格和時(shí)代氣魄的美，具有了一定的珍藏價(jià)值和欣賞意義。

4.包裝設(shè)計(jì)的傳播性

包裝設(shè)計(jì)還具有其審美的傳播性。在現(xiàn)代激烈競(jìng)爭(zhēng)的市場(chǎng)環(huán)境中，好的包裝設(shè)計(jì)不僅能讓廠商獲得豐厚的利潤(rùn)和效益，而且還能使消費(fèi)者在購(gòu)買(mǎi)商品使用價(jià)值的同時(shí)得到美的享受。應(yīng)該說(shuō)，商品的外表包裝是商品走向市場(chǎng)的必要組成部分。它是直接與顧客相識(shí)的首當(dāng)其沖的因素，消費(fèi)者正是通過(guò)它傳達(dá)的相關(guān)文字、圖形、色彩信息，直觀有效地認(rèn)識(shí)和把握商品品質(zhì)的優(yōu)劣，本身與商品性質(zhì)的適合度，做出是否喜愛(ài)和購(gòu)買(mǎi)的決策。

包裝設(shè)計(jì)的流行滲透著審美觀念的流行。包裝設(shè)計(jì)歸根到底是人的設(shè)計(jì);是以人的需要為主要功能的設(shè)計(jì);是植根于自身的歷史背景、文化傳統(tǒng)和民族精神的設(shè)計(jì)，真正流行與審美的設(shè)計(jì)是真實(shí)、科學(xué)、合理的設(shè)計(jì)。包裝設(shè)計(jì)的根本原則是藝術(shù)性與功能性的完美結(jié)合，任何脫離或有悖于功能性的所謂藝術(shù)性，都將失去其存在的意義;任何只注重功能性而沒(méi)有藝術(shù)性的設(shè)計(jì)，也喪失了包裝設(shè)計(jì)的藝術(shù)靈魂。我們要真正做到藝術(shù)性與功能性的完美結(jié)合，充分發(fā)揮出包裝設(shè)計(jì)的實(shí)用功能和審美價(jià)值，創(chuàng)造出更大的商業(yè)和文化價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 黃俊彥，邢浩.現(xiàn)代商品包裝視覺(jué)傳達(dá)設(shè)計(jì)[J].包裝世界，2005，（3）.

[2] 鄭秀敏.淺議現(xiàn)代包裝設(shè)計(jì)[J].甘肅農(nóng)業(yè)，2005，（9）.

第5篇：細(xì)胞核的功能范文

【摘要】

目的 觀察新診斷老年糖尿?。―M）患者胰島β細(xì)胞功能特點(diǎn)及其與胰淀素、褪黑素的關(guān)系。方法 收集初診DM患者60例，其中老年DM組27例，成年DM組33例，對(duì)照組30例。均行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT），計(jì)算胰島β細(xì)胞功能指數(shù)（HOMAβ）。采用ELISA法檢測(cè)患者空腹血清胰淀素、褪黑素水平。同時(shí)測(cè)定所有受試者的血脂、體重指數(shù)（BMI）和腰臀比（WHR），并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 （1）老年DM組與成年DM組比較HOMAβ明顯降低〔(58.20±24.89) vs (81.20±40.80)，P

【關(guān)鍵詞】 糖尿??；老年；胰島β細(xì)胞功能；胰淀素；褪黑素

老年糖尿病（DM）與成年DM比較具有起病隱匿、癥狀不典型、進(jìn)展緩慢等特點(diǎn)，其發(fā)病原因尚不明了，胰島β細(xì)胞功能下降是其發(fā)病的主要機(jī)制之一。胰淀素和褪黑素是分別由胰腺和松果腺分泌的老年相關(guān)激素，近年國(guó)外有些研究表明胰淀素、褪黑素與老年DM的發(fā)生有一定的關(guān)系〔1，2〕。本研究通過(guò)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT），分析老年DM患者的胰島β細(xì)胞功能特點(diǎn)；并檢測(cè)老年DM患者血清胰淀素、褪黑素的濃度，進(jìn)一步探討兩種老年相關(guān)激素與胰島β細(xì)胞功能的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

病例組60例，為2007年10月至2009年8月期間在我院內(nèi)分泌科住院及門(mén)診新診斷的2型糖尿?。═2DM）患者，年齡25～94歲，均未接受胰島素治療，符合下列標(biāo)準(zhǔn)：（1）行OGTT后均符合1999年WHO T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）空腹胰島素（Fins）≥5 μIU/ml；（3）空腹血糖（FPG）≤10 mmol/L。（4）谷氨酸脫羧酶抗體、胰島細(xì)胞自身抗體均陰性。按發(fā)病年齡分為兩組，老年DM組（≥60歲）27例，男14例，女13例，平均年齡（74.59±8.79）歲，成年≥組（25～59歲）33例，男17例，女16例，平均年齡（45.76±8.54）歲。健康老年對(duì)照組30例，選擇同期健康體檢者，年齡、性別與老年糖尿病組相匹配，無(wú)吸煙史，排除糖尿病、糖耐量減低、冠心病、高血壓、腦血管病及腫瘤等疾病。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集

所有受試者對(duì)本試驗(yàn)知情。老年健康體檢者在禁食12～14 h后，在無(wú)應(yīng)激情況下采空腹肘靜脈血。60例DM人均做OGTT及胰島素釋放試驗(yàn)，清晨空腹取靜脈血后一次性口服75 g葡萄糖，并分別于0.5、1、2、3 h后取靜脈血做血糖及胰島素測(cè)定。所有收集的血液分離出血清，于-70 ℃冰箱中保存待用。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)

采用OLYMPUS AU540全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清甘油三酯（TG）、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）和血清葡萄糖（GLU）。胰島素(INS)測(cè)定采用電化學(xué)發(fā)光免疫法，試劑由羅氏公司提供，儀器：電化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)定儀2010Elecsys。胰淀素、褪黑素測(cè)定采用ELISA，應(yīng)用美國(guó)R&D公司試劑盒（板內(nèi)板間變異系數(shù)均小于10%），按說(shuō)明書(shū)操作。腰圍、臀圍、身高、體重由專(zhuān)人測(cè)定。

1.2.3 計(jì)算指標(biāo)

體重指數(shù)（BMI）=體重（kg）/身高2（m2）。腰臀比（WHR）=腰圍（cm）/臀圍（cm）。按HOMA模型計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)〔HOMAIR=(Fins×FPG)/22.5〕及胰島β細(xì)胞功能指數(shù)〔HOMAβ=20×Fins/(FPG-3.5)〕。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行，連續(xù)性計(jì)量資料以x±s表示，非正態(tài)分布的資料以對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布后輸入。兩組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn) ，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用直線(xiàn)相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 各DM組OGTT各點(diǎn)血糖、胰島素值的比較

老年DM組OGTT 2 h血糖及胰島素值均高于成年DM組（均P

2.2 各組研究對(duì)象的臨床指標(biāo)比較

老年DM組與成年DM組比較，HOMAβ、TG均明顯降低（P

2.3 老年糖尿病組HOMAβ與其他指標(biāo)的相關(guān)性

在老年DM組內(nèi)，HOMAβ與褪黑素呈明顯正相關(guān)（r=0.403，P=0.016），與胰淀素(r=-0.461，P=0.003)、HOMAIR(r=-0.238，P=0.009)呈明顯負(fù)相關(guān)，與FPG、INS、TG、WHR則無(wú)明顯相關(guān)性，見(jiàn)表3。表3 老年糖尿病組胰島β細(xì)胞功能與其他指標(biāo)的相關(guān)性(略)

3 討 論

胰淀素，又稱(chēng)胰島淀粉樣多肽（IAPP），在胰島β細(xì)胞和胰島素一起表達(dá)、合成、分泌，被認(rèn)為是胰島素的孿生兄弟，各種影響胰島素分泌的因素同時(shí)也影響胰淀素的分泌。本研究結(jié)果顯示，老年DM組血清胰淀素水平明顯高于老年健康組，與國(guó)外〔3〕的研究結(jié)果相一致。相關(guān)分析還顯示HOMAβ與胰淀素、HOMAIR呈明顯負(fù)相關(guān)，說(shuō)明增高的胰淀素可能是老年糖尿病患者胰島素分泌缺陷的一個(gè)重要原因。胰淀素之所以能夠?qū)е乱葝u功能受損，一方面可能由于胰淀素能抑制胰島素的釋放，提高血漿游離脂肪酸的水平，抑制肌肉組織對(duì)葡萄糖的攝取，抑制肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用和促進(jìn)葡萄糖的產(chǎn)生而誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生。另一方面，胰淀素可自我聚集、變性、沉積在胰島β細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)直接的氧化作用，在細(xì)胞膜形成特異性鈣離子通道，增加P53和P21的表達(dá)等機(jī)制引起胰島β細(xì)胞的損傷和凋亡，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞絕對(duì)數(shù)目的減少〔4〕，使胰島素分泌最終減少。

通過(guò)抑制胰淀素的代謝異常、阻止胰淀素的聚集或拮抗其作用，均具有抗老年糖尿病的潛力。以胰淀素為作用靶點(diǎn)的藥物將可能成為治療老年糖尿病的全新手段。

褪黑素，N乙酰5甲氧基色胺，是色氨酸的衍生物。近年研究表明其是迄今已知的最強(qiáng)的自由基清除劑，能對(duì)抗氧化應(yīng)激，對(duì)DM及其并發(fā)癥有一定的治療作用〔5，6〕。Ha等〔7〕通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明褪黑素在分子水平上對(duì)血糖有穩(wěn)定作用，并進(jìn)一步推斷老化使內(nèi)源性褪黑素水平下降，可能與老年DM的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本文亦發(fā)現(xiàn)，老年DM組血清褪黑素水平明顯低于健康對(duì)照組，進(jìn)一步說(shuō)明了衰老導(dǎo)致的褪黑素水平下降可能為老年DM發(fā)生的原因之一。經(jīng)相關(guān)分析，本文還發(fā)現(xiàn)HOMAβ與褪黑素呈正相關(guān)。大量的動(dòng)物及人體試驗(yàn)也證明褪黑素能夠降低血糖，對(duì)胰島β細(xì)胞具有保護(hù)作用〔8，9〕。

綜上，胰淀素、褪黑素均與老年糖尿病胰島β細(xì)胞功能有一定的相關(guān)性，但具體的分子機(jī)制目前尚不清楚，仍有待進(jìn)一步深入研究。由于本研究樣本量有限，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量更深入了解胰淀素、褪黑素與老年DM胰島β細(xì)胞功能的相互關(guān)系，從而尋求有效預(yù)防及治療老年DM的新途徑。

參考文獻(xiàn)

1 Zraika S，Hull RL，Udayasankar J，et al.Glucoseand time dependence of islet amyloid formation in vitro〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2007;354:2349.

2 Peschke E.Melatonin，endocrine pancreas and diabetes〔J〕.J Pineal Res，2008;44(1)：2640.

3 Hoppener JW，Nieuwenhuis MG，Vroom TM，et al.Islet amyloid and diabetes mellitus type 2〔J〕.Ned Tijdschr Geneeskd，2000;144(42):19952000.

4 Butler AE，Jang J，Gurlo T，et al.Diabetes due to a progressive defect in betacell mass in rats transgenic for human islet amyloid polypeptide (HIP Rat)：a new model for type 2 diabetes〔J〕.Diabetes，2004;53(6):150916.

5 Andersson AK，Sandler S.Melatonin protects against streptozotocin，but not interleukin1 betainduced damage of rodent pancreatic betacells〔J〕. J Pineal Res，2001;30(3):157165.

6 Kurcer Z，Parlakpinar H，Vardi N，et al.Protective effects of chronic melatonin treatment against renal ischemia/reperfusion injury in streptozotocininduced diabetic rats〔J〕.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2007;115(6):36571.

7 Ha E，Yim SV，Chung JH.Melatonin stimulates glucose transport via insulin receptor substrate1/phosphatidylinositol 3kinase pathway in C2C12 murine skeletal muscle cells〔J〕.J Pineal Res，2006;41(1):6772.

第6篇：細(xì)胞核的功能范文

關(guān)鍵詞: 腎病綜合征;受體，白細(xì)胞介素2;T淋巴細(xì)胞;免疫，細(xì)胞

摘 要:目的 觀察原發(fā)性腎病綜合征（PNS）患者細(xì)胞免疫功能變化. 方法 采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血清可溶性白細(xì)胞介素2受體（sIL-2R），流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血T細(xì)胞亞群（CD3+ ，CD4+ ，CD8+ ）及紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)（RBC-C3b RR）和紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)（RBC-ICR）試驗(yàn). 結(jié)果 原發(fā)性腎病綜合征組sIL-2R明顯高于對(duì)照組［（398±122）vs（202±84）pmol?L-1 ，P

+ ，CD8+ 較對(duì)照組明顯降低（0.50±0.08）vs（0.71±0.07），（0.26±0.07）vs（0.36±0.07），（0.22±0.05）vs（0.31±0.06），P

Keywords:nephrotic syndrome;receptors，interleukin-2;T-lymphocytes;immunity，cellular

Abstract:AIM To investigate cellular immune function and　erythrocyte immune function in patients with primary nephrotic syndrome（PNS）.METHODS Soluble interleukin2receptors（sIL-2R）were detected by ELISA.T-lympho-cyte subsets（CD3+ ，CD4+ and CD8+ ）were also evaluated by flow cytometry（FCM）.The red blood cell C3b receptor rosette（RBC-C3b RR）and the red blood cell immune com-plexs rosette（RBC-ICR）were measured.RESULTS Serum sIL-2R levels were significantly higher in PNS than in normal controls ［（398±122）vs（202±84）pmol?L-1 ，P

0 引言

研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體免疫功能的異常或紊亂是引起腎臟疾病的基礎(chǔ)［1，2］ ，它在腎臟疾病的免疫發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到重視［3，4］ .我們通過(guò)檢測(cè)原發(fā)性腎病綜合征（PNS）患者血清可溶性白細(xì)胞介素2受體（sIL-2R），T細(xì)胞亞群及紅細(xì)胞免疫功能，旨在探討PNS患者細(xì)胞免疫功能變化的意義.

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 PNS患者40（男22，女18）例，年齡16～64（平均40）歲，均為住院患者，通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢查及臨床確診.對(duì)照組20（男13，女7）例，年齡20～40（平均30）歲，血、尿常規(guī)及肝腎功能正常.

1.2 方法

1.2.1 血清SIL-2R的測(cè)定 采用雙抗體夾心ELISA法，試劑盒由第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室提供，具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行. 1.2.2 T細(xì)胞亞群的測(cè)定 取抗凝全血100μL，分別加10μL FITC標(biāo)記抗CD3、抗CD4、抗CD8和IgG鼠單抗混勻，室溫放置15min后，用QPREP自動(dòng)細(xì)胞制備儀（Bekmn-coulter公司產(chǎn)品），加ABC液溶解紅細(xì)胞和穩(wěn)定淋巴細(xì)胞，輕輕搖蕩10min立即用ProfileⅡ型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Coullter公司產(chǎn)品）分析，所用激光光源為15mW氫離子激光，波長(zhǎng)為A488nm ，檢測(cè)1000個(gè)以上細(xì)胞.

1.2.3 紅細(xì)胞免疫功能的測(cè)定 采用C3b 受體花環(huán)（RBC-C3b RR）和紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)（RBC-ICR）試驗(yàn)（第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室提供）.預(yù)備試驗(yàn):將補(bǔ)體致敏的酵母和未致敏的酵母凍干試劑，按說(shuō)明書(shū)要求溶解、洗滌，配制成1×1011 個(gè)?L-1 的密度;另取患者末梢血或肝素125kU?L-1 抗凝血1滴，加入2mL生理鹽水，每次經(jīng)2000r?min-1 離心3min后，配制成1.25×1010 個(gè)?L-1 密度的紅細(xì)胞懸液.

吸取致敏酵母菌懸液與未致敏酵母菌懸液各50μL，分別加入試管中，混勻，置37℃水浴中30min后取出涂片，加2.5g?L-1 戊二醛1滴，輕輕混勻，自然干燥，進(jìn)行姬姆薩染色，用油鏡（Olympus，日本產(chǎn)）觀察.1個(gè)紅細(xì)胞上結(jié)合兩個(gè)或兩個(gè)以上酵母菌者為1個(gè)陽(yáng)性花環(huán)細(xì)胞，共計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞，計(jì)算出RBC-C3b RR和RBC-ICR的百分率（%）.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x ±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，用SPLM統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果

2.1 sIL2R及T淋巴細(xì)胞亞群的變化 PNS患者外周血sIL-2R水平較對(duì)照組明顯增高，有顯著差異（P

+ ，CD8+ 較對(duì)照組明顯降低，有顯著差異（P

表1 sIL-2R及T淋巴細(xì)胞亞群的變化　略

2.2 紅細(xì)胞免疫功能的變化 PNS患者RBC-C3bRR明顯低于對(duì)照組，有顯著差異（P

表2 紅細(xì)胞免疫功能的變化　略

3 討論

PNS是由原發(fā)性腎臟病引起，并非是細(xì)菌等致病因子直接侵犯腎臟引起，而是與免疫反應(yīng)相關(guān)，當(dāng)致病的抗原進(jìn)入人體后，被吞噬細(xì)胞攝取，淋巴細(xì)胞對(duì)這些抗原進(jìn)行識(shí)別引起免疫反應(yīng)，造成腎小球損傷.目前已證實(shí)是一組免疫介導(dǎo)性疾病［5］ .T淋巴細(xì)胞亞群是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要因素，體內(nèi)免疫平衡是通過(guò)輔T細(xì)胞CD4+ 和抑制性T細(xì)胞CD8+ 形成的T細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)來(lái)維持調(diào)節(jié)免疫功能的平衡［6］ ，二者的升高與降低，均可使兩者的比例失調(diào)，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的異?；蛭蓙y［7］ .免疫學(xué)研究證實(shí)，紅細(xì)胞具有抗原提呈細(xì)胞作用，能促進(jìn)T細(xì)胞的免疫功能，擴(kuò)大細(xì)胞免疫效應(yīng)，參與細(xì)胞免疫調(diào)控［8］ ，并能清除體內(nèi)的免疫復(fù)合物，促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬功能，調(diào)節(jié)體液免疫和細(xì)胞免疫，粘附自身的T細(xì)胞，增強(qiáng)T細(xì)胞免疫功能，更有效地清除免疫復(fù)合物［9］ .本資料顯示PNS患者血清sIL-2R水平明顯高于對(duì)照組（P

參考文獻(xiàn):

［1］Sun JF，Zhao BS，Gu Q，Duan YY，Li GY，Zhang XL，Zhang RD.Prostaglandin-E1 delays deterioration of renal function ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（7）:887-889.

［2］Sun JF，Jiao K，F(xiàn)u EQ，Li GY，Zheng Y，Zhang GL，Bai XF.Transfusion transmitted virus infection in hemodialysis patients with chronic renal failure ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（6）:767-769.

［3］Liu XW，Li DM，Li YX，Zhao ZH，Xu YQ.Effect of corticos-teroids on TNFαlevel in patients with primary nephritic syn-drome ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（8）:721-724.

［4］Sun JF，Jiao K，Gu Q，Li GY，Li ZT，Zhang XL，Zhang L.Ef-fect of prostaglandin-E1on plasma endothelia and calcitonin gene related peptide in patients with chronic renal failure ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（4）:480-482.

［5］Liu XW，Zhu MZ，Li DM，Wang HM，Chen W，Liu SQ，Zhu J.Changes of renal tissue TNF-αplasma TNF-αand urine TNF-αin patients with primary nephritic syndrome ［J］.Linchuang Neike Zazhi（J Clin Intern Med），2001;18（1）:51-52.

［6］Li XM，Chen JZ，Zhang NY，Nan Y，Xie YH.Association of TCM-bion zheng with T-lymphrocyte subsets and thyroidism in patients with diabetes mellitus ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（2）:233-234.

［7］Xu LY，Zhang YH，Xin GW，Zhang LC，Yin Y，Hao XK.Sig-nificance of T-lymphrocyte subset，erythrocyte immune function and Ag-NORs in nucleolar organizer region in patients with car-cinoma of endometrium ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（4）:353-355.

［8］Gao W，Huang YX，Zhao NX，Wang QL，Zhang HX.Influence of electroacupuncture on T-lymphrocyte subgroups of peripheral blood and erythrocyte immune function in rats ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（4）:414-416.

［9］Hou JF，Zhang YH，Shi HJ，Hao XK，Zhao LC，Deng XB.Ef-fect of Yangyin Kangdu powder on erythrocyte immune adhesion function in irradiated mice ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（4）:496-498.

［10］Liu JH，He WX.T-lymphrocyte subsets analysis with flowcy-tometry in children with primary nephritic syndrome ［J］.Shen-zangbing Yu Touxi&yizhi Zazhi（J Nephrol Dialy Transplant），2001;10（2）:123-129.

第7篇：細(xì)胞核的功能范文

【摘要】 目的 觀察連枷胸犬胸壁加壓包扎、肋骨牽引和手術(shù)內(nèi)固定的治療效果。方法 實(shí)驗(yàn)用Beagle犬24只，隨機(jī)分為A組(對(duì)照組)、B組(包扎治療組)、C組(牽引治療組)和D組(手術(shù)固定組)，每組6只，建立大面積(15cm2/kg)浮動(dòng)胸壁動(dòng)物摸型。用MPA動(dòng)物肺功能記錄儀、血?dú)夥治觥⑿厍恢霉艿扔^察犬呼吸頻率(RR)、潮氣量(Vt)、每分鐘靜息通氣量(VE) 、肺順應(yīng)性(CL)、氣道阻力(Raw)、動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、動(dòng)脈血二氧化碳分壓(PaCO2)、動(dòng)脈血氧飽和度(SaO2)、剩余堿(BE)及胸膜腔內(nèi)壓(IPP)等變化，比較胸壁加壓包扎、肋骨牽引固定和手術(shù)內(nèi)固定的治療效果。結(jié)果 浮動(dòng)胸壁模型完成后，均出現(xiàn)反常呼吸，胸膜腔內(nèi)壓負(fù)壓絕對(duì)值減小(P

【關(guān)鍵詞】 連枷胸；生理學(xué)；肋骨骨折；牽引術(shù)；包扎；內(nèi)固定

Abstract： Objective To study curative effect of pressure dressing on chest wall，traction and internal fixation on pulmonary function in dogs with flail chest.Methods A total of 24 Beagle dogs were set up as great floating thoracic wall models(15cm2/kg)， then pided into internal fixation group，rib skeletal traction group，pressure dressing group and control group randomly，with 6 dogs in each group.The change of respiratory rate(RR)，tidal volume(Vt)，minute ventilation(VE)，lung compliance(CL)，airway resistance(Raw)，partial pressure of oxygen in artery (PaCO2)，partial pressure of carbon dioxide in artery(PaCO2)，arterial oxygen saturation(SaO2)，base excess(BE)，intrapleural pressure(IPP) were observed and recorded by MPA pulmonary function recorder and blood gas analysis.At last the therapeutic effect was compared among 4 groups.Results Paradoxical respiration occurred；intrapleural pressure decreased(P

Key words：flail chest;physiology;rib fracture;traction;dressing；internal fixation

連枷胸是最嚴(yán)重的胸壁損傷，其病死率達(dá)12%～50%［1］。對(duì)連枷胸浮動(dòng)胸壁固定治療，其固定方法的選擇與對(duì)連枷胸所牽涉的復(fù)雜的病理生理的認(rèn)識(shí)密切相關(guān)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者大多認(rèn)為連枷胸所致的呼吸困難主要是由肺挫傷和反常呼吸引起［2］ 。筆者通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，排除肺挫傷的影響。觀察大面積浮動(dòng)胸壁對(duì)犬呼吸功能的影響以及胸壁加壓包扎、肋骨牽引和手術(shù)內(nèi)固定治療的作用。

材料與方法

1 動(dòng)物分組與模型建立

試驗(yàn)用Beagle犬24只，體重為(10.32±1.56)kg。用3%戊巴比妥鈉(25mg/kg)靜脈注射麻醉，氣管插管后在右側(cè)胸部相應(yīng)面積(15cm2/kg)肋骨的兩端切開(kāi)胸壁皮膚，各游離肋骨3cm，保持胸膜完整，切斷并剪去肋骨1cm，以確保損傷區(qū)域的胸壁能隨呼吸自由浮動(dòng)，縫合切口。模型制成后，隨機(jī)分為4組，每組各6只犬（雌雄不拘）。A組為對(duì)照組，不進(jìn)行治療干預(yù)；B組為包扎治療組：以浮動(dòng)胸壁為中心，選用相應(yīng)大小的厚棉墊加壓包扎，使浮動(dòng)胸壁極度內(nèi)陷，進(jìn)而消除反常呼吸；C組為牽引治療組：行肋骨巾鉗懸吊牽引固定，牽引重量為0.5～1kg，以正好對(duì)抗反常呼吸運(yùn)動(dòng)為宜；D組行手術(shù)切開(kāi)復(fù)位，鋼板＋螺絲釘內(nèi)固定治療。上述3種治療方法，在治療過(guò)程中均需保持胸膜腔完整。

2 觀察指標(biāo)

對(duì)實(shí)驗(yàn)犬行全麻氣管插管后，氣管插管外接MPA動(dòng)物肺功能記錄儀，測(cè)呼吸頻率（RR）、潮氣量(Vt)、每分鐘通氣量(VE)、肺順應(yīng)性(CL)、氣道阻力(Raw)。于術(shù)側(cè)腋中線(xiàn)第8肋間置胸腔管，接MPA動(dòng)物肺功能記錄儀測(cè)胸膜腔內(nèi)壓（IPP），適時(shí)記錄測(cè)量結(jié)果。采抽取動(dòng)脈血測(cè)動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、動(dòng)脈血二氧化碳分壓(PaCO2)、動(dòng)脈血氧飽和度(SaO2)、剩余堿（BE）、SB等。分別記錄模型建立前、制模1小時(shí)、A組制模4小時(shí)、B、C、D組模型建立后4小時(shí)的上述觀察指標(biāo)。

3 數(shù)據(jù)處理

所測(cè)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用多個(gè)樣本均數(shù)間的多重比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法（SNKq）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

結(jié) 果

浮動(dòng)胸壁模型完成后，24只犬均出現(xiàn)胸壁反常運(yùn)動(dòng)，浮動(dòng)幅度2～3cm。胸膜腔內(nèi)壓負(fù)壓絕對(duì)值減小(P

討 論

1 連枷胸行胸壁固定治療的理論依據(jù)

胸壁的完整性對(duì)呼吸功能的維持有重要作用。連枷胸肺容量的減少主要是胸壁不穩(wěn)及肺挫傷所致的纖維化導(dǎo)致。通常將連枷胸分類(lèi)為前外側(cè)區(qū)和后外側(cè)區(qū)，兩種類(lèi)型均包含側(cè)面區(qū)域，該區(qū)有反映呼吸力學(xué)的前鋸肌指狀突的插入。Borrelly等［3］報(bào)道前鋸肌在連枷區(qū)錯(cuò)位復(fù)雜的病理生理過(guò)程中有重要作用，當(dāng)涉及肩關(guān)節(jié)活動(dòng)或作為吸氣肌時(shí)，連于每根肋骨上的前鋸肌指狀突有如拉抽屜一樣使連枷區(qū)錯(cuò)位，使其向后上方移位，由此產(chǎn)生肋骨斷端重疊，并會(huì)導(dǎo)致傷者肺容量減少的惡性循環(huán)。外科手術(shù)固定骨折肋骨可有效防止或中止肋骨錯(cuò)位的惡性循環(huán)，早期復(fù)位和固定骨折肋骨，恢復(fù)胸壁的幾何形狀，保持胸壁的完整性，避免了因胸壁變形對(duì)肺功能的損害。Voggenreiter等［4］證實(shí)了對(duì)無(wú)肺挫傷連枷胸患者首先行手術(shù)治療的重要性。據(jù)Clark等［5］統(tǒng)計(jì)31％的孤立性肺挫傷患者需要機(jī)械通氣治療，而57％的孤立性連枷胸患者需要機(jī)械通氣治療，再次強(qiáng)調(diào)了胸壁機(jī)械性完整性的重要作用。

2 胸壁加壓包扎固定的治療效果

20世紀(jì)初期對(duì)連枷胸采用捆綁固定的方法進(jìn)行治療，當(dāng)時(shí)認(rèn)為包扎固定可增加胸壁穩(wěn)定性、減少疼痛和可能有助于咳嗽。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在大面積連枷胸包扎固定后與對(duì)照組比較，IPP、Raw、RR顯著升高（P

3 牽引固定的治療效果

肋骨牽引固定是過(guò)去臨床常用于浮動(dòng)胸壁的一種方法，認(rèn)為牽引固定后連枷胸側(cè)胸壁的幾何形狀可恢復(fù)，胸腔容積可增加，牽引固定保持了胸壁的完整性，避免了因胸壁變形對(duì)其下肺區(qū)域的壓迫，從而能產(chǎn)生足夠的潮氣量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，牽引治療后Vt、Raw顯著升高（P0.1）。說(shuō)明牽引治療后實(shí)驗(yàn)犬的潮氣量雖有部分增加，但I(xiàn)PP、PaO2、PaCO2、SaO2、BE、CL、VE、RR變化不明顯，其低氧狀態(tài)未能得到有效改善。這主要是因?yàn)榇竺娣e浮動(dòng)胸壁形成后，牽引固定雖能部分改善通氣，但由于牽引外力持續(xù)作用于傷側(cè)胸壁，對(duì)抗其彈性回縮，被牽引的浮動(dòng)胸壁無(wú)法與健側(cè)胸壁進(jìn)行協(xié)同呼吸運(yùn)動(dòng)，無(wú)法恢復(fù)肋骨生理狀態(tài)杠桿作用，胸廓生理狀態(tài)的完整性未能得以恢復(fù)，肺的順應(yīng)性改善不明顯，故呼吸功能仍不能恢復(fù)正常，缺氧狀態(tài)無(wú)法得到有效改善。所以，至少對(duì)于大面積連枷胸來(lái)說(shuō)，單純行牽引固定無(wú)法達(dá)到滿(mǎn)意療效。

4 手術(shù)內(nèi)固定的治療效果

1975年Richardson等［6］首次報(bào)道了用鋼絲修復(fù)胸骨骨折的方法。連枷胸手術(shù)內(nèi)固定可有效地減少機(jī)械通氣時(shí)間和ICU時(shí)間，減少肺炎的發(fā)病率及降低病死率，恢復(fù)胸壁的幾何形狀及生理狀態(tài)的完整性，恢復(fù)肋骨生理狀態(tài)杠桿作用，提高傷側(cè)肺的順應(yīng)性，進(jìn)而改善呼吸功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，手術(shù)內(nèi)固定治療后PaO2、PaCO2、SaO2、CL、Vt、VE顯著升高（P

參考文獻(xiàn)

［1］Kadam PP，Agarwal SP，Pantvaidya SH.Management of chest wall injuries :a comparison of ventilatory and nonventilatory therapy［J］.Indian J Anaesth，2003，47(2)：100-104.

［2］Freeland M，Robert F，Jeffery S，et al.The management of chest injury：factors affecting outcome［J］.J Trauma，1990，30(12)：1460-1468.

［3］Borrelly J，Aazami MH.New insights into the pathophysiology of flail segment:the implications of anterior serratus muscle in parietal failure［J］.Eur J Cardiothorac Surg，2005，28(5):742-749.

［4］Voggenreiter G，Neudeck F，Aufmkolk M，et al.Operative chest wall stabilization in flail chest: outcomes of patients with or without pulmonary contusion［J］.J Am Coll Surg，1998，187(2):130-138.

第8篇：細(xì)胞核的功能范文

【摘要】 目的：探討他克莫斯（tacrolimus， FK506）對(duì)大鼠骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)分化、成熟和免疫學(xué)活性的影響. 方法：收集大鼠骨髓源性DCs，加入不同濃度的FK506進(jìn)行培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞術(shù)行DCs表型分析，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL12 的水平并行體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR），觀察DCs對(duì)同種T細(xì)胞的刺激能力. 構(gòu)建大鼠腎移植模型，于移植前7 d輸注FK506處理的DCs，觀察移植腎存活時(shí)間. 采用ELISA法檢測(cè)MLR培養(yǎng)上清和移植大鼠血清中TH1/TH2細(xì)胞因子IFNγ，IL2，IL4 和IL10的表達(dá)水平. 結(jié)果：FK506對(duì)DCs表面分子(Iad，CD80和CD86)的表達(dá)無(wú)明顯影響(P>0.05)，而IL12的分泌水平降低(P

【關(guān)鍵詞】 他克莫斯; 樹(shù)突狀細(xì)胞; 免疫耐受; 器官移植

【Abstract】 AIM: To investigate the effect of tacrolimus (FK506) on the differentiation， maturation and function of rat bone marrowderived dendritic cells (DCs). METHODS: We added tacrolimus at concentrations of 5-20 μg/L to the DCs culture and checked the expressions of activation markers (Iad， CD80 and CD86) by flow cytometry， the release of cytokines IL12 by ELISA and the stimulatory capacity of the resulted DCs by mixed lymphocyte reaction (MLR). Thirty Wistar rats were pided into 3 groups (n=10 in each): group A accepted kidneys from SD donors; group B was infused with DCs derived from SD donors 7 d before transplantation; group C was the same as that in group B except the DCs were treated with tacrolimus during culture. The functions of the transplanted kidneys were evaluated by urine volume and ELISA was used to detect the levels of Th1/Th2 cytokines， such as IFNγ， IL2， IL4 and IL10 in the MLR and in the sera of the recipients 7 d after culture or transplantation. RESULTS: Even at the stimulation of lipopolysaicharide (LPS)， in the tacrolimustreated culture， we observed no significant effects on the expressions of activation markers (Iad， CD80 or CD86). The release of IL12 and the stimulatory capacity of tacrolimustreated DCs were reduced， compared with control DCs (P

【Keywords】 tacrolimus; dendritic cells; immune tolerance; organ transplantation

0引言

樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells， DCs)是專(zhuān)職性抗原遞呈細(xì)胞(antigenpresent cell，APC)，它與效應(yīng)T 細(xì)胞的相互作用決定著免疫應(yīng)答的發(fā)生(激活/耐受)及強(qiáng)度. 近年來(lái)，DCs在移植免疫耐受誘導(dǎo)、自身免疫性疾病和變態(tài)反應(yīng)性疾病的治療等方面展現(xiàn)出獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值［1］. 我們觀察了他克莫斯（tacrolimus， FK506）對(duì)骨髓源性DCs成熟與免疫功能的影響，初步探討FK506在免疫應(yīng)答早期抗原提呈過(guò)程中的作用.

1材料和方法

1.1材料

健康雄性Winstar大鼠和SD大鼠，體質(zhì)量250～350 g（上海斯萊克公司），在無(wú)特定病原體(specific pathogenfree， SPF)環(huán)境中飼養(yǎng). FK506（日本藤澤制藥公司）；重組粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rGMCSF)與外源性脂多糖(LPS)（Sigma公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清（Gibco公司）；PE標(biāo)記的小鼠抗大鼠Iad，CD80，CD86 mAb（eBioscience公司）；IL12，IL4，IL10，IL2， IFNγ的ELISA試劑盒（Bender公司）；3HTdR（Amersham Life Science公司）. EpicXL型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BeckmanCoulter公司).

1.2方法

1.2.1骨髓來(lái)源DCs的提取與鑒定參照文獻(xiàn)［2］的方法，取SD大鼠（供者）股骨，沖洗出骨髓細(xì)胞，以1∶10的體積比加入37℃預(yù)溫的TrisNH4Cl去除紅細(xì)胞；加GNK緩沖液終止反應(yīng)，離心洗滌2次；用RPMI 1640調(diào)細(xì)胞密度為1×109/L，37℃， 50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)2 h；輕輕洗去非粘附細(xì)胞；在貼壁細(xì)胞中加入含10 μg/L rrIL4和10 μg/L rrGMCSF的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，37℃， 50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)6～7 d，收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的DCs備用.

1.2.2DCs表型與分泌IL12水平分析將DCs分成4組，每組設(shè)3復(fù)孔：① 對(duì)照組(DCs組)；② FK506處理組(FK506DCs組)：培養(yǎng)液中加入不同濃度FK506（5， 10， 20 μg/L）；③ 脂多糖刺激組(LPSDCs組)：在培養(yǎng)結(jié)束前18 h加入100 μg/L LPS；④ FK506處理+脂多糖刺激組(FK506LPSDCs組). 在37℃， 50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)7 d，收集培養(yǎng)上清液，ELISA方法檢測(cè)IL12水平（按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）. 收獲細(xì)胞（2×109/L）；分別加入PE標(biāo)記的抗Iad， 抗CD80或抗CD86 mAb(終濃度5 mg/L)，4℃作用45 min；流式細(xì)胞儀分析，以中位熒光強(qiáng)度（MFI）作為檢測(cè)指標(biāo).

1.2.3體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)分析取Winstar大鼠（受者）脾臟，制備無(wú)菌脾細(xì)胞懸液；過(guò)尼龍毛柱獲取非粘附的T 淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，37℃， 50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)1 h，調(diào)細(xì)胞密度為1×109/ L. 以25 mg/L絲裂霉素滅活SD大鼠DCs（DCs；LPSDCs；FK506DCs）作為刺激細(xì)胞( 2×108/L)，37℃， 50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)30 min；刺激細(xì)胞/應(yīng)答細(xì)胞( S/E) 以不同濃度比(1∶5， 1∶10， 1∶20)加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，總反應(yīng)體積為200 μL，含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h；于培養(yǎng)結(jié)束前18 h每孔加入3HTdR 3.7×104 Bq；β計(jì)數(shù)儀測(cè)量待測(cè)細(xì)胞的3HTdR摻入值(cpm).

1.2.4大鼠腎移植模型的建立與分組以SD大鼠為供體、Wistar大鼠為受體，參照文獻(xiàn)［3］加以改進(jìn)，采用腎動(dòng)脈與腹主動(dòng)脈端側(cè)吻合、腎靜脈cuff套管法吻合、供體膀胱瓣與受體膀胱吻合. 將受者Wistar大鼠分為3組，每組10只.① 對(duì)照組(A組)；② DCs 組(B組)：腎移植術(shù)前7 d自大鼠尾靜脈注入DCs 細(xì)胞懸液0.5 mL (4×109/L)；③ FK506DCs 組(C組)：腎移植術(shù)前7 d注入FK506DCs細(xì)胞懸液0.5 mL (4×109/L). 術(shù)后于代謝籠內(nèi)培養(yǎng)，觀察大鼠移植腎存活情況，出現(xiàn)無(wú)尿即認(rèn)為移植腎臟失功能.

1.2.5Th1/Th2細(xì)胞因子測(cè)定在體外MLR中，加入3HTdR前收集培養(yǎng)上清；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，移植7 d后抽取受鼠尾靜脈血并分離血清，ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)IFNγ， IL2， IL4和IL10 水平.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 應(yīng)用SPSS 10.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理， 兩組間比較采用隨機(jī)分組t檢驗(yàn)方法， 多組間比較采用單因素方差分析方法， 以P

2結(jié)果

2.1DCs表型分析FK506DCs組Iad，CD80和CD86的表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05). LPS刺激后，Iad，CD80和CD86的表達(dá)顯著增加，與未處理組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05，表1).表1他克莫斯(FK506)和外源性脂多糖(LPS)對(duì)DC表面分子表達(dá)的影響 (略)

2.2DCs分泌細(xì)胞因子IL12檢測(cè)在DCs培養(yǎng)的第7日，F(xiàn)K506DCs組培養(yǎng)上清中的IL12水平分別為: 5 μg/L組(105.0±9.5) ng/L；10 μg/L組（74.4±6.6） ng/L； 20 μg/L組（41.7±3.9） ng/L. 明顯低于DCs組的(176.8±19.7) ng/L (P

2.3DCs對(duì)同種T 細(xì)胞MLR檢測(cè)LPS刺激活化的DCs可以誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，F(xiàn)K506處理的DCs促進(jìn)T細(xì)胞增殖的能力明顯受到抑制，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

2.4移植物的存活時(shí)間對(duì)照組移植腎臟的存活時(shí)間(6.3±0.7) d與DCs組 (7.2±1.4) d比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)K506DCs組移植腎臟的平均存活時(shí)間延長(zhǎng)至(19.0±2.3) d，同另兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

2.5Th1/Th2細(xì)胞因子檢測(cè)在體外MLR（圖3）和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（圖4）中，F(xiàn)K506處理DCs組與DCs組比較，IL2，IFNγ水平均明顯降低(P

3討論

近幾年，DCs在移植免疫耐受中的作用逐漸受到重視［1］. DCs是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的APCs［4-5］，也是唯一能夠激活初始型T 細(xì)胞啟動(dòng)初次免疫應(yīng)答的APCs，調(diào)節(jié)免疫激活/耐受的平衡［6］. 從上世紀(jì)九十年代初開(kāi)始，F(xiàn)K506作為免疫抑制劑應(yīng)用于器官移植領(lǐng)域，因?yàn)槠鋸?qiáng)效、低毒性等特點(diǎn)，在短短的十幾年臨床應(yīng)用過(guò)程中，以FK506為基礎(chǔ)的免疫抑制方案已經(jīng)逐步超過(guò)以環(huán)孢霉素為基礎(chǔ)的免疫抑制方案，成為臨床器官移植免疫抑制的首選藥物. 迄今為止，對(duì)FK506免疫抑制效應(yīng)的理解集中在其對(duì)T淋巴細(xì)胞的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，既抑制T 淋巴細(xì)胞的增殖和免疫效應(yīng)因子如IL2，IFNγ等的分泌. 最近有研究表明［7-9］，F(xiàn)K506也能夠影響DCs的成熟和功能，在免疫應(yīng)答早期既抗原提呈過(guò)程中發(fā)揮作用.

我們用大鼠骨髓造血干細(xì)胞成功地誘導(dǎo)出DCs，并在體外觀察FK506對(duì)DCs細(xì)胞表型和刺激T細(xì)胞活化增殖能力的影響. 發(fā)現(xiàn)FK506并不影響DCs表面共刺激分子CD80，CD86和MHCII類(lèi)分子Iad的表達(dá)，這些分子是DCs成熟的標(biāo)志. 在實(shí)驗(yàn)中加入LPS刺激加速了DCs的成熟過(guò)程，而FK506對(duì)這一過(guò)程同樣無(wú)抑制作用，提示FK506并不影響DCs的成熟過(guò)程. IL12是DCs成熟過(guò)程中分泌的一種主要的效應(yīng)細(xì)胞因子，能促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為T(mén)h1細(xì)胞，從而誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng). FK506處理DCs的IL12分泌水平明顯降低， 即使加入LPS刺激后IL12的分泌也無(wú)明顯增加， 提示FK506抑制DCs的抗原提呈功能可能是通過(guò)降低IL12的分泌來(lái)完成.

在體外混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中，F(xiàn)K506處理的供者來(lái)源的DCs，可明顯抑制T 淋巴細(xì)胞的增殖與活化，并呈現(xiàn)為劑量依賴(lài)關(guān)系. 在大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)K506DCs回輸給受者后可明顯延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間. FK506DCs回輸作為一種簡(jiǎn)單易行的方法，更易于進(jìn)入移植臨床，雖然應(yīng)用FK506誘導(dǎo)免疫耐受尚有待研究，但至少可以降低移植受者術(shù)后免疫抑制劑用量，減少藥物的毒副作用. 在體外MLR和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，均發(fā)現(xiàn)經(jīng)FK506處理的DCs可顯著降低Th1亞群淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平，而Th2亞群細(xì)胞因子的分泌水平顯著提高，表明FK506處理的DCs能抑制T淋巴細(xì)胞向Th1的分化，并誘導(dǎo)其向Th2分化，這可能是移植物長(zhǎng)期存活的主要或至少是相關(guān)的重要因素. IL10在體內(nèi)外表達(dá)水平的差異說(shuō)明體內(nèi)環(huán)境遠(yuǎn)較體外復(fù)雜，這可能是某些效果明顯的體外研究，進(jìn)入臨床卻不盡人意的原因之一. 在臨床實(shí)踐中，部分器官移植受者在因?yàn)楦鞣N原因的免疫抑制劑裁撤過(guò)程中表現(xiàn)出特異的免疫無(wú)反應(yīng)性，我們推測(cè)，F(xiàn)K506對(duì)DCs的影響可能在這一現(xiàn)象中發(fā)揮作用.

總之，探討FK506對(duì)抗原呈遞細(xì)胞、特別是DCs的作用，必將加深和完善對(duì)FK506免疫抑制作用機(jī)制的理解，使其更合理的應(yīng)用于臨床，而FK506表現(xiàn)出的誘導(dǎo)免疫耐受的作用也為免疫耐受的誘導(dǎo)方法提供一個(gè)全新的切入點(diǎn).

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金（C0510033）

【參考文獻(xiàn)】

［1］王翔， 趙鴻， 張?jiān)?，? 未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠免疫低反應(yīng)性［J］. 中華器官移植雜志， 2005， 4: 203-206.

［2］Inaba K， Inaba M， Romani N， et al. Generation of large numbers of dendritic cells from bone marrow culture supplemented with granulocyte/ macrophage colonystimulating factor［J］. J Exp Med， 1992， 176: 1693-1702.

［3］劉小友， 于立新， 孫煦勇，等. 腹主動(dòng)脈搭橋、硬膜外導(dǎo)管內(nèi)撐法建立大鼠腎移植模型［J］. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志， 2004， 6: 744-746.

［4］田蓉，李巍，于繼云，等.小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27(10):895-897.

［5］張?jiān)骑w，范清宇.人外周血樹(shù)突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)、培養(yǎng)及其表面標(biāo)記的鑒定［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005， 26(24):2300.

［6］湯志剛， 王春友， 胡何節(jié). 轉(zhuǎn)染CTLA4 Ig基因的樹(shù)突狀細(xì)胞抑制反應(yīng)性T細(xì)胞增殖［J］. 中華器官移植雜志， 2006， 6: 327-329.

［7］Lee YR， Yang IH， Lee YH， et al. Cyclosporin A and tacrolimus， but not rapamycin， inhibit MHCrestricted antigen presentation pathways in dendritic cells［J］. Blood， 2005， 105(10): 3951-3955.

［8］Krummen MB， Varga G， Steinert M， et al. Effect of pimecrolimus vs. corticosteroids on murine bone marrowderived dendritic cell differentiation， maturation and function［J］. Exp Dermatol， 2006，15(1):43-50.

第9篇：細(xì)胞核的功能范文

本研究從[專(zhuān)業(yè)提供寫(xiě)作論文和論文寫(xiě)作服務(wù)，歡迎您的光臨dylw.net]種植體周?chē)谆颊呙撀浞N植體周?chē)墙M織中獲取成骨細(xì)胞，通過(guò)對(duì)炎癥與正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比，探討種植體周?chē)讓?duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為種植修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本收集

種植體周?chē)椎墓墙M織樣本來(lái)自中國(guó)總醫(yī)院種植科，選取患者年齡小于等于60歲、種植體植入年限小于等于3年、種植于磨牙區(qū)且因種植體周?chē)壮霈F(xiàn)種植體脫落的患者4例，刮取種植體附著以及種植窩中的骨組織。正常組織來(lái)源的樣本來(lái)自中國(guó)總醫(yī)院口腔外科，選取4例身體健康的相同年齡段的第三磨牙拔除術(shù)患者，夾取舌側(cè)骨板。所有患者均排除牙周炎，且近期沒(méi)有急性感染、糖尿病、家族遺傳病和骨質(zhì)疏松癥等全身系統(tǒng)性疾病。本研究已經(jīng)中國(guó)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且每例患者均簽署了知情同意書(shū)。

1.2 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)與純化

PBS反復(fù)沖洗5次組織塊，將較大的組織塊剪為1 mm3大小，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入含有13.7 g·L-1 Ⅳ型膠原酶（北京索萊寶科技有限公司）和5 g·L-1胰蛋白酶（Amresco公司，美國(guó)）的消化液，37 ℃震蕩消化45 min。1 000 r·min-1離心8 min，去上清，加入H-DMEM培養(yǎng)液（GIBCO公司，美國(guó)）和10%胎牛血清（Invitrogen公司，美國(guó)），吸管反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后觀察細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)情況，待鋪皿80%進(jìn)行傳代。采用反復(fù)貼壁法[3]對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化。

1.3 堿性磷酸酶鑒定染色

將第3代分離純化后的成骨細(xì)胞以每孔1×104個(gè)的密度接種于24孔板，細(xì)胞達(dá)70%時(shí)，用4%多聚甲醛在4 ℃固定30 min。PBS反復(fù)沖洗后，使用堿性磷酸酶試劑盒（Sigma公司，美國(guó)）染色1 h。PBS反復(fù)沖洗后，在倒置相差顯微鏡下進(jìn)行常規(guī)觀察及照相。

1.4 MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第3代細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后離心加入DMEM（10%胎牛血清）終止成細(xì)胞混懸液，調(diào)整密度為2×104個(gè)·mL-1接種于96孔板，每孔0.2 mL。貼壁后隔天換液，連續(xù)培養(yǎng)8 d。每隔24 h取3孔，每孔加入20 μL 5 g·L-1 MTT溶液，37 ℃、5%

CO2[專(zhuān)業(yè)提供寫(xiě)作論文和論文寫(xiě)作服務(wù)，歡迎您的光臨dylw.net]孵箱中孵育4 h，加入二甲基亞砜200 μL。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot法檢測(cè)成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白OCN的表達(dá)

取第3代細(xì)胞進(jìn)行接種，培養(yǎng)7 d后，將細(xì)胞用0.01 mol·L-1 PBS反復(fù)沖洗3遍，裂解細(xì)胞提取蛋白。取等量蛋白經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，脫脂奶粉封閉過(guò)夜。加入鼠抗人OCN（Abcam公司，英國(guó)）（1︰1 000稀釋?zhuān)┖?beta;-actin（1︰2 000稀釋?zhuān)?7 ℃孵育2 h，洗膜后，經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG2a（Abcam公司，英國(guó)）（1︰4 000稀釋?zhuān)┓跤?0 min，化學(xué)發(fā)光法顯示抗原抗體復(fù)合物，X線(xiàn)片顯影并定影，所有雜交信號(hào)經(jīng)成像分析儀系統(tǒng)測(cè)定條帶密度進(jìn)行定量分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin的比值表示蛋白的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及純化

種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞與正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中狀態(tài)基本相同，10～14 d時(shí)從組織塊中爬出，形狀多為不規(guī)則形和三角形（圖1）。反復(fù)貼壁法純化成骨細(xì)胞貼壁后，2種來(lái)源的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上無(wú)明顯差異，細(xì)胞均呈長(zhǎng)梭形和多邊形，胞核可見(jiàn)多核仁，呈圓形或橢圓形（圖2）。

2.2 堿性磷酸酶鑒定染色

細(xì)胞固定后按堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒要求進(jìn)行檢測(cè)，可見(jiàn)藍(lán)黑色顆粒沉積在胞漿堿性磷酸酶活性部位（圖3）。2種來(lái)源細(xì)胞都表現(xiàn)出了堿性磷酸酶陽(yáng)性，但正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞比種植體周?chē)讈?lái)源成骨細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)更多染色顆粒。

2.3 2種來(lái)源的成骨細(xì)胞增殖能力的比較

MTT檢測(cè)結(jié)果（圖4）表明，正常組織來(lái)源與種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞都表現(xiàn)出了一定的體外擴(kuò)增能力，從第4天起2種來(lái)源細(xì)胞的增殖能力出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞的增殖活力明顯低于正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞。

2.5 2種來(lái)源的成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白的比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，培養(yǎng)7 d時(shí)，與正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞相比，種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞OCN的表達(dá)降低，相對(duì)灰度值分析表明種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞OCN的表達(dá)水平約為正常組織來(lái)源的1/3（P<0.05）（圖6）。

3 討論

骨結(jié)合是牙種植手術(shù)的基礎(chǔ)。種植體與頜骨骨性結(jié)合面的形成與種植區(qū)的骨密度密切相關(guān)，骨密度越高，種植體與骨的結(jié)合率就越高[4]。種植體周?chē)渍窃谘仔晕h(huán)境下，破壞了種植體與頜骨的骨結(jié)合，從而使種植體周?chē)喂墙M織的功能喪失。成骨細(xì)胞在骨組織的修復(fù)和改建中起到重要作用，是維持骨組織新陳代謝[專(zhuān)業(yè)提供寫(xiě)作論文和論文寫(xiě)作服務(wù)，歡迎您的光臨dylw.net]的主要細(xì)胞；因此，研究炎癥組織來(lái)源的成骨細(xì)胞很有意義。

本研究從種植體周?chē)追N植體脫落患者的頜骨骨組織中分離培養(yǎng)獲得了炎癥組織來(lái)源的成骨細(xì)胞，通過(guò)比較炎癥組織來(lái)源的成骨細(xì)胞和正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞的增殖能力以及相關(guān)骨組織修復(fù)基因的表達(dá)等生物學(xué)功能變化，探討炎性微環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

本實(shí)驗(yàn)選用的成骨細(xì)胞均為第4代以?xún)?nèi)的細(xì)胞，結(jié)果表明，炎癥組織來(lái)源的細(xì)胞在體外培養(yǎng)后仍然具有一定的炎癥組織來(lái)源特異性。炎性細(xì)胞因子和種植體周?chē)字虏【亩玖σ蜃訒?huì)導(dǎo)致成骨細(xì)胞的增殖能力顯著 下降。本研究結(jié)果顯示，種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞雖然在形態(tài)學(xué)上并沒(méi)有表現(xiàn)出和正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞有明顯差異，但是在細(xì)胞增殖活力方面表現(xiàn)出了不同，種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞的增殖活力整體低于正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞。筆者認(rèn)為這是由于種植體周?chē)椎难仔晕h(huán)境抑制了成骨細(xì)胞的增殖能力。

Runx2和Col Ⅰ是反應(yīng)成骨細(xì)胞分化能力的重要指標(biāo)，Runx2是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在骨組織的形成與重建過(guò)程中具有重要的作用[5]。炎性因子會(huì)影響Runx2的表達(dá)從而抑制成骨細(xì)胞的分化能力[6-7]。Col Ⅰ是成骨細(xì)胞分化成骨的重要基質(zhì)。研究[8]表明，種植體周?chē)椎凝l溝液中Col Ⅰ水平下降。本研究結(jié)果顯示，種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞的Runx2和Col Ⅰ表達(dá)水平相比正常組織來(lái)源顯著下降，表明炎性微環(huán)境可影響成骨細(xì)胞的成骨分化能力，抑制Runx2和Col Ⅰ的正常表達(dá)，這與Liu等[9]對(duì)干細(xì)胞的研究結(jié)果一致。

OCN與成骨細(xì)胞的礦化緊密相關(guān)，在一定程度上反應(yīng)了成骨細(xì)胞礦化的能力。學(xué)者[10]研究證實(shí)炎性微環(huán)境會(huì)降低[專(zhuān)業(yè)提供寫(xiě)作論文和論文寫(xiě)作服務(wù)，歡迎您的光臨dylw.net]OCN的表達(dá)。本研究中，種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞由于在炎性微環(huán)境下降低了OCN mRNA的表達(dá)，從而導(dǎo)致OCN蛋白水平也明顯降低?？梢?jiàn)炎性微環(huán)境抑制了成骨細(xì)胞礦化的能力。

炎性微環(huán)境下成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能受多方面調(diào)控，通過(guò)對(duì)比種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞和正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能變化，可以確定炎性微環(huán)境下成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能受到影響，成骨分化及礦化能力顯著降低，這是種植體周?chē)墙M織吸收的重要原因。其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的深入研究。