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在廢水處理中,生物處理法是最為經(jīng)濟適用的廢水處理方法,而微生物在生物處理過程中又起到至關重要的作用,利用微生物治理水污染有著廣闊的發(fā)展前景。本文重點探討微生物在廢水處理中的應用。
關鍵詞:
環(huán)保;微生物;應用
環(huán)境保護是我國的基本國策。隨著水污染問題的日益嚴峻,水資源危機嚴重威脅人類的生存環(huán)境。在廢水處理中,生物處理法是最為經(jīng)濟適用的廢水處理方法,而微生物在生物處理過程中又起到至關重要的作用。隨著現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展,構建基因工程菌已成現(xiàn)實,所以,利用微生物治理水污染有著廣闊的發(fā)展前景。本文重點探討微生物在廢水處理中的應用。
1廢水中常見的微生物
2微生物在廢水處理方面的應用
微生物處理廢水的機理就是通過微生物的新陳代謝活動,把廢水中的有機物質降解轉化為穩(wěn)定的、無害的物質,從而達到凈化廢水的方法。根據(jù)微生物新陳代謝過程中是否有氧的參與,廢水的微生物凈化方法分為好氧凈化和厭氧凈化。
2.1好氧凈化在有氧的條件下,好氧微生物通過自身的分解、合成代謝,把廢水中的有機物礦物化的過程。在這個過程中,微生物不僅自身得到了生長、繁殖。廢水也得到凈化。廢水微生物好氧凈化法就是模擬這個原理來凈化污水的。目前常用的好氧廢水處理法有:活性污泥法、生物膜法、氧化塘法等?;钚晕勰喾?活性污泥其實就是廢水中的好氧微生物生長、繁殖形成的一種絮狀體。其生物組成為好氧微生物、兼性厭氧微生物和專性厭氧微生物、有機和無機固體等?;钚晕勰嗑哂泻軓姷奈?、氧化分解有機物或毒物的能力?;钚晕勰喾ㄌ幚韽U水就是利用活性污泥的吸附、氧化、分解、凝聚和沉淀等作用來凈化水中的有機污染物。廢水中的有機物的降解轉化過程就是活性污泥中的好氧微生物的新陳代謝活動。為保證最佳凈水效果,就要保證微生物良好的新陳代謝。氧的充足供應是好氧微生物進行正常生命活動的首要條件。所以,首先要保證氧的供應。此外,還要滿足微生物生命活動最適宜的溫度(15-30℃)和ph值(6.5-8.5)等。生物膜法:這種處理法的實質是使細菌等微生物和原生動物、后生動物等附著在濾料或載體上生長繁育,并在其上形成膜狀生物污泥---生物膜。常見的生物膜法有生物濾池、生物轉盤、生物接觸氧化、生物流化床等。氧化塘法氧化塘中,廢水中的污染物主要通過懸浮于廢水中的有機菌藻共生作用、水中微生物代謝活動進行降解,水中藻類光合作用能增高溶解氧濃度,氧化塘廢水中的細菌可將廢水有機物分解變成二氧化碳、硝酸根等無機物,沉積于污泥中的有機物則可通過厭氧菌分解成甲烷、硫化氫等被藻類利用,從而使廢水得到凈化。
2.2厭氧凈化在嚴格厭氧的條件下,微生物發(fā)酵和消化有機物產(chǎn)生水、二氧化碳、硫化氫、甲烷的過程。廢水的厭氧處理法就是根據(jù)這一原理來凈化污水的。因在處理過程中產(chǎn)生甲烷,又稱甲烷發(fā)酵。廢水中復雜有機物的厭氧降解過程分四個階段,即:水解階段、發(fā)酵階段、產(chǎn)乙酸階段、產(chǎn)甲烷階段。不同的階段有著不同的微生物優(yōu)勢種群。在水解發(fā)酵階段中,廢水中的大分子有機物,首先在細菌胞外酶的作用下,水解轉化為小分子有機物后,被梭狀芽孢桿菌屬、丁酸弧菌屬、雙歧桿菌屬和假單胞菌屬等吸收、轉化為更為簡單的化合物分泌到胞外,主要產(chǎn)物是醇類、揮發(fā)性的脂肪酸、乳酸、二氧化碳、氫氣、氨等等。在產(chǎn)氫、產(chǎn)乙酸階段中,這些產(chǎn)物繼續(xù)被互營單胞菌屬、互營桿菌屬、暗桿菌屬和梭菌屬等酸化細菌進一步轉化為乙酸、氫氣、碳酸及新的細胞物質。在產(chǎn)生甲烷階段中,前一階段的產(chǎn)物被甲烷桿菌屬、甲烷球菌屬和甲烷八疊球菌屬等甲烷菌群利用轉化為甲烷菌細胞物質,并產(chǎn)生甲烷氣體。整個廢水厭氧發(fā)酵過程涉及多種菌替作用,每種菌群都有不同的生活基質和生活條件要求,構成了一個極為復雜的生態(tài)系統(tǒng)。這種廢水處理方法不僅菌群獲得營養(yǎng),廢水得到凈化,還能開發(fā)新的生物能源,所以倍受人們重視。
3利用分子生物學技術,人工構建基因工程菌處理廢水
相比較于傳統(tǒng)的微生物處理廢水法,利用基因工程菌處理廢水是當前用微生物處理廢水的重要發(fā)展方向,它具有定向性和高效性的特點。構建的基因工程菌,不僅能在廢水處理過程中快速繁殖、絮凝,滿足數(shù)量需求,而且在高毒環(huán)境的水體中,也具有高效的分解、轉化性能,甚至可以針對特異的污染物進行分解、轉化,基因工程菌也可以廣泛的分解污染物。隨著基因工程技術和現(xiàn)代分子生物學技術的快速發(fā)展,基因工程菌對凈化環(huán)境、保護人類健康將發(fā)揮越來越重要的作用,基因工程菌在廢水處理中的應用也將越來越廣泛。微生物法處理廢水不僅具有效率高、成本較低的特點,而且處理后的水質好,可以直接排放到大自然中。在自然界,廣泛的存在著大量的微生物。微生物具有易培養(yǎng)、易變異、繁殖快、適應能力強等特征。隨著基因工程技術和現(xiàn)代分子生物學技術的快速發(fā)展,構建定向、高效分解污染物的微生物已成為現(xiàn)實。所以,利用微生物治理廢水是今后環(huán)保產(chǎn)業(yè)的主攻方向,合理利用微生物處理廢水具有非常廣闊的發(fā)展前景。
參考文獻
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藥學專業(yè)主要課程 主要課程:基本原理、思想道德修養(yǎng)、法律基礎、大學英語、高等數(shù)學、醫(yī)用物理學、計算機基礎、形態(tài)學概論、生理學、細胞生物學、分子生物學。
醫(yī)學免疫學、病理生理學、醫(yī)學微生物學、無機化學、有機化學、生物化學、定量分析、儀器分析、物理化學、基礎化學實驗、藥物化學、天然藥物化學、藥劑學、藥物分析、藥理學、毒理學基礎、藥物的波譜解析、藥事管理學、專業(yè)技能實驗等。
藥學專業(yè)就業(yè)前景 我國的藥學事業(yè)的發(fā)展也是非常迅猛的,許多藥品都得到了國際市場的認可,也與外國企業(yè)建立了合作關系,但在專業(yè)人才方面有稀缺,這表明藥學專業(yè)有很廣闊的發(fā)展前景。
社會對藥學才的需求正在增加,本專業(yè)的大學生就業(yè)率高達95%。制藥業(yè)發(fā)展較快,尤其是生活水平提高以后,人們對保健品的需求在增大,企業(yè)對藥學人才比較青睞。還有一塊就是生化藥品,這是一個新興也是尖端的行業(yè),發(fā)展前景很好。
藥學專業(yè)畢業(yè)生主要分配到制藥廠和醫(yī)藥研究所從事各類藥物開發(fā)、研究、生產(chǎn)質量保證和合理用藥等方面的工作,也有很多人從事藥品銷售。
藥學專業(yè)就業(yè)方向 本專業(yè)學生畢業(yè)后可可以到制藥廠和醫(yī)藥研究所從事各類藥物開發(fā)、研究、生產(chǎn)質量保證和合理用藥等方面的工作,藥學專業(yè)就業(yè)方向也有很多人從事藥品銷售。
從事行業(yè):
畢業(yè)后主要在制藥、醫(yī)療、新能源等行業(yè)工作,大致如下:
1 制藥/生物工程;
2 醫(yī)療/護理/衛(wèi)生;
3 新能源;
4 醫(yī)療設備/器械;
5 批發(fā)/零售。
從事崗位:
畢業(yè)后主要從事醫(yī)藥代表、銷售代表、產(chǎn)品經(jīng)理等工作,大致如下:
1 醫(yī)藥代表;
2 銷售代表;
3 產(chǎn)品經(jīng)理;
4 藥劑師;
基于與業(yè)務主管部門和登記注冊管理部門前期積極的工作交流,“人才聯(lián)盟”落戶海南進入加速實施階段,相關人才項目的準備工作基本完成,現(xiàn)將近期工作匯報如下:
一、“人才聯(lián)盟”申請成立進度
積極與相關領導深入溝通交流,在充分闡述“人才聯(lián)盟”成立的初衷、即將開展的業(yè)務范圍、廣泛深遠的社會經(jīng)濟意義以及發(fā)展前景的基礎上,對可行性征詢材料進行了系統(tǒng)的完善。
“人才聯(lián)盟”籌備委員會已經(jīng)在第一時間通知所有發(fā)起單位、會員單位以及捐資單位按照成立登記申請相關要求完成相關材料的整理,近期提交籌委會進行審核、報送社會團體管理處。
二、首批外籍院士工作站項目
為抓緊落實人才交流大會上關于“百位外籍院士入海南”的簽約合作以及推進首批外籍院士工作站項目,“人才聯(lián)盟”籌委會依托聯(lián)盟平臺優(yōu)勢整合國際人才資源,已經(jīng)累計與24名外籍院士及2名重要領域博士確立合作關系,外籍院士及博士分別來自俄羅斯、烏克蘭、哈薩克斯坦、烏茲別克斯坦和中國,涉及領域涵蓋公共衛(wèi)生、醫(yī)療、環(huán)境保護、新能源、可再生能源、生物科學、生態(tài)系統(tǒng)、農(nóng)業(yè)技術、新材料、機械科學、電真空技術、船舶技術設計和物理化學等領域,分別為農(nóng)業(yè)學、無線電物理學、低溫物理學、聲學、熱物理學、光學、固態(tài)物理學、核物理學、雷達技術、電磁場與微波技術、高功率微波技術、超導體學、生物能源、新能源、綜合醫(yī)學、臨床醫(yī)學、病理學、神經(jīng)生理學、血液學、免疫學、腫瘤學、高科技醫(yī)學工程、微血管學、心臟外科、分子診斷、基因組學、蛋白質組學、系統(tǒng)生物學、生物化學、分子生物學、遺傳學、天然及合成化合物技術、化學物理學、晶體量子化學、固體量子化學、高分子物理學、高分子化合物、納米材料、復合材料、聚合過程動力熱力學、動力工程學、爆炸物理學、核技術以及流體力學等學科的專家。2名外籍博士為各自所在領域的高端技術研究人才,所掌握技術為無線電應用和探地雷達領域核心技術,可填補國內(nèi)在該領域的空白。
【關鍵詞】生物催化技術發(fā)展化學制藥研究
生物催化是指通過酶或生物有機體的催化作用實現(xiàn)生物的化學轉化,故又被稱為生物轉化。隨著科技的進步和發(fā)展,生物催化逐漸進入人們的生產(chǎn)生活,從根本上改善了人們的經(jīng)濟效益、能源消耗和原料來源,對環(huán)境保護也作出了積極貢獻。生物催化技術是生物技術改革中的第三次浪潮,成為歷年來生物技術中的標志性技術。
1.生物催化技術及其發(fā)展
(1)生物催化技術。經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)指出,生物酶催化技術是目前工業(yè)發(fā)展中最有利于可持續(xù)發(fā)展的一項技術。生物催化技術主要涉及到化學領域和生物學領域,在醫(yī)藥化工領域中可通過酶或微生物的催化作用實現(xiàn)大規(guī)模生物的轉化。生物催化技術在很大程度上促使衍生物往多樣性方向發(fā)展,實現(xiàn)對復雜產(chǎn)物的結構修飾及簡單分子化合物庫的新建,產(chǎn)物在經(jīng)過生物催化后能夠延伸出現(xiàn)的生理活動物質。
先導化合物在生物催化作用下具有一定的優(yōu)越性,主要體現(xiàn)在以下幾點:①可能反應的產(chǎn)物范圍大;②在反應過程中無需進行脫保護和基團保護,一步便可完成相關反應;⑧實現(xiàn)生產(chǎn)的定向立體選擇和區(qū)域選擇;④生物催化的反應條件溫和,利于穩(wěn)定復雜的分子結構;⑤在均一和溫和的反應條件下可獲取反應的重現(xiàn)性及實現(xiàn)反應的自動化;⑥由于酶具有固定化特性,故在生產(chǎn)過程中可反復循環(huán)使用催化劑。
(2)生物催化技術的發(fā)展。生物催化技術的提出是源于科學家對活體細胞成分的認識,一部分的專家和學者認為某些細胞成分可用于特定條件下的化學轉化。例如苯甲醛從植物中提取后與氫氰酸結合可制成(R)一苯乙醇腈,半合成抗生素的生產(chǎn)則依靠G酞基轉移酶的幫助。1980年后,隨著科技的發(fā)展和進步,蛋白質工程技術得到空前的發(fā)展,使得酶的底物范圍大大增加,實現(xiàn)了常見合成中間物的生物合成。在此科技背景之下,生物催化技術逐漸被運用于精細化化學和藥物中間體生產(chǎn)領域。
(3)隨著近年來基因合成、生物信息學、蛋白質工程和序列分析等觀念的進步及電腦建模和生物學工具的更新,越來越多的專家學者在分子生物學的基礎上對分子進行快速進化處理,極大的改善了原有的生物催化劑。生物催化劑經(jīng)過改造后可穩(wěn)定處:T-60℃的有機溶液中,在接受新的底物時可自動催化新的生物反應。
2.化學制藥中的生物催化技術研究
在生物催化技術的發(fā)展背景之下,酶和微生物反應成為生物學領域的關注熱點。許多長期研究微生物和酶的專家學者開始著手于有機合成的研究,促使生物催化技術逐漸發(fā)展成為一項不對稱合成的生物技術。
(1)西他列汀游離堿。美國的Codexis公司和德國的Merck公司通過酶做催化劑實現(xiàn)西他列汀游離堿的生產(chǎn)。他們較早發(fā)現(xiàn)R構型選擇性轉氨酶的分子結構類似于西他列汀酮,其中一些分子質量較小的可阻斷甲基酮并具有一定活性。而后Codexis公司對轉氨-酶進行改造,實現(xiàn)了一種催化加氫路線的構建,且在生產(chǎn)過程中并不產(chǎn)生S豐勾型西他列汀酮。由于該生物技術具有一步到位的優(yōu)點,故設備的生產(chǎn)能力和分子的反應能力得到有效提高,且在一定程度上降低了廢棄物品的產(chǎn)出。
(2)阿伐他汀(立普妥)。6-氰3和5一二羥基乙酸叔丁酯是阿伐他汀(立普妥)生產(chǎn)過程中需要的活性中間體,美國Codexis公司通過生物催化實現(xiàn)此種活性中間體的生產(chǎn)。Codexis公司以分子重組為基礎,采用了最先進的直接優(yōu)化技術,開發(fā)了具有穩(wěn)定性、選擇性和活性的3種酶。前手性氯酮在2種優(yōu)化酶手性選擇性的催化作用下發(fā)生氫化反應,生成純手性的氯乙醇。
(3)普瑞巴林。美國的Pfizer公司通過生物催化的方式實現(xiàn)普瑞巴林的生產(chǎn)。基于蛋白質工程技術進行改造的水解酶問世后,運用該水解酶會對S-2-羧乙基-3氰基-5-甲基乙酸的鉀鹽進行選擇性水解,在溫和條件下物質發(fā)生一系列水解反應,最終得到普瑞巴林。-2-羧乙基-3氰基-5-甲基乙酸在脂肪酶的選擇性水解下產(chǎn)出-2-羧乙基-3氰基-5-甲基乙酸的鉀鹽,在此基礎上進行化學合成,實現(xiàn)普瑞巴林的制備,可獲取40%的最終收率,通過對目標產(chǎn)物的檢測可得其ee值為99.7%。
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關鍵詞 嗜鹽菌;高鹽濃度;細菌視紫紅質
中圖分類號:Q93 文獻標識碼:A 文章編號:1671-7597(2013)13-0009-02
1 嗜鹽菌的嗜鹽機制
1.1 嗜鹽菌的細胞壁
1.1.1 成分的特異性
嗜鹽菌細胞壁不含有肽聚糖,卻有富含酸性氨基酸的糖蛋白,這些帶有負電荷的氨基酸比如谷氨酸、天門冬氨酸等。這樣在高鹽濃度的溶液里面,鈉離子會結合在嗜鹽菌的表面,正好屏蔽掉這些氨基酸所帶的負電荷。因此Na+對于嗜鹽菌細胞壁的結構完整具有重要意義。
1.1.2 嗜鹽菌細胞壁對一定鹽濃度的依賴性
嗜鹽菌在高鹽的溶液里,鈉離子會結合在嗜鹽菌細胞壁表面,屏蔽其所帶的負電荷。當溶液中的鈉離子不足或鈉離子被稀釋時,蛋白質的負電荷部分就會互相排斥,細胞壁會一塊一塊地破碎,最終導致細胞裂解。
1.2 嗜鹽菌的細胞膜
1.2.1 嗜鹽菌細胞膜上的細菌視紫紅質
嗜鹽菌細胞膜上含有與視覺中的視紫紅質相類似的蛋白質,被稱為細菌視紫紅質(bacteriorhodopsin,bR)。細菌視紫紅質有光驅動質子泵功能。細菌視紫紅質中視黃醛分子的結構一般是全-反式(all-trans),但是在光照條件下,視黃醛分子會發(fā)生13-順式(13-cis)的結構異構化,H+經(jīng)中間形態(tài)泵出膜外,最后細菌視紫紅質返回初態(tài)B,這樣就完成了光循環(huán)。隨著質子累積在膜的外表面,質子驅動力增加,直到膜兩側的質子差可以驅動膜上的ATP酶時,ATP酶就可以開始ATP的合成。因此,嗜鹽菌可以利用光能進行低速增長,使嗜鹽菌更能適應一些能量不足的環(huán)境。
1.2.2 嗜鹽菌細胞膜保鉀排鈉的功能
嗜鹽菌細胞質中的Na+離子的濃度并不高,但是細胞質中的K+離子的濃度卻很高,可以高達7 mol/L。這是由于某些嗜鹽菌具有Na+/K+反向轉運功能,而這種功能是正是利用了光介導的H+質子泵,它具有向外排放Na+和吸收和濃縮K+的能力。這樣可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外的滲透壓來對抗細胞外的高滲環(huán)境,提高它的耐鹽性。
1.3 嗜鹽菌的細胞質
1.3.1 嗜鹽菌細胞質維持胞內(nèi)滲透壓平衡的方法
嗜鹽菌主要依靠兩條途徑來維持胞內(nèi)滲透壓平衡,其一是細胞中聚集無機鹽離子如K+,其二是聚集相容性物質如糖類、甜菜堿和四氫嘧啶等。嗜鹽菌還能產(chǎn)生和積累一些相容性溶質,既能幫助正常的細胞代謝活動,又有助于平衡胞內(nèi)外滲透壓。比如在一種嗜鹽外硫紅螺菌(Ectothiorhodospira sp.)中發(fā)現(xiàn)環(huán)狀氨基酸,它在細胞內(nèi)含量可達0.25 mol/L,約占胞內(nèi)全部有機溶質的10%,成為此類嗜鹽菌的主要的滲透壓調(diào)節(jié)劑,有助于穩(wěn)定和保護菌體內(nèi)酶的活性,使其能夠在高鹽濃度下正常生長。
1.3.2 嗜鹽菌中酶與蛋白質的嗜鹽機制
高鹽溶液會使普通蛋白質的水膜遭到破壞,導致蛋白質間的疏水作用加強,使蛋白質空間結構發(fā)生變換,甚至失活變性。而在嗜鹽菌的細胞質中,卻含有高濃度的鉀離子。這些鉀離子不僅能夠調(diào)節(jié)胞內(nèi)外滲透壓的平衡,也是嗜鹽菌酶與蛋白質保持活性的條件。嗜鹽菌的酶與普通蛋白質不同,它在酶的表面引入了酸性氨基酸的殘基。酸性氨基酸能在蛋白質和酶表面形成一層薄薄的水保持層,阻止蛋白質分子與酶相互碰撞,從而避免了它們之間的凝集。同時,堿性氨基酸殘基能與酸性氨基酸形成鹽橋來消除鹽離子的屏蔽效應。相反在低鹽濃度下,由于電荷的排斥作用,酶和蛋白質就會變性失活。
2 嗜鹽菌嗜鹽機制的應用前景
2.1 細菌視紫紅質在生物電子領域的應用
細菌視紫紅質的非線性光學性、瞬態(tài)光電響應性和光致變色性等都特別優(yōu)秀,因此它在很多方面都擁有廣闊的前景,比如生物芯片、神經(jīng)網(wǎng)絡、人工視網(wǎng)膜和光信息存儲等領域都有發(fā)展前景。另外,在太陽能利用方面,利用bR蛋白質的質子泵作用,可以研制天然的太陽能電池和對海水進行淡化。
2.2 利用嗜鹽菌處理高鹽度廢水
高鹽度廢水大量含有無機鹽離子和有機物質。過高離子濃度對微生物生長有十分強烈的毒性,因此高鹽度廢水給生物處理帶來一定的難度。利用生物方法處理高濃度的污染物,就必須用到嗜鹽菌。大多數(shù)專家認為,利用生物法處理高鹽度廢水在技術上是可行的,因為在高鹽環(huán)境中嗜鹽菌對污染物的降解作用十分有效。而嗜鹽菌對于鹽度的高低十分敏感,鹽度對于嗜鹽菌處理有機污染物的脫氮、除磷和降解都有或大或小的影響。因此想要用嗜鹽菌處理高鹽度廢水的方法實施起來,還需要在很多方面進一步的研究和改進。
2.3 利用嗜鹽菌研制工業(yè)耐鹽酶
工業(yè)上使用的耐鹽酶很多都是來自嗜鹽菌。在以色列,Mevarechy領導的小組在大腸桿菌中將嗜鹽二氫葉酸和蘋果酸脫氫酶基因成功表達出來,這使得耐鹽酶也能在大腸桿菌中生產(chǎn)。嗜鹽菌在工業(yè)廢水處理中也有很大的作用,嗜鹽堿放線菌(Nocrdioides sp.M6)對于2,4,6-三氯酚有很強的降解作用,利用這一特性,可以來處理工業(yè)廢水,還可用于環(huán)境治理等。
2.4 嗜鹽菌相容性溶質的應用
嗜鹽菌在高鹽度的環(huán)境中,在胞內(nèi)形成了很多相容性溶質。這些溶質包括甘氨酸甜菜堿、四氫嘧啶、谷氨酰胺和海藻糖等。羥基四氫嘧啶和四氫嘧啶可以作為穩(wěn)定劑,它可以保護蛋白質等,使其抗凍、抗鹽、抗干燥。在很多化妝品中,羥基四氫嘧啶和四氫嘧啶都是其中的重要成分,例如德國的莫克公司就曾經(jīng)生產(chǎn)過一種化妝品,就利用它來抗衰老和抗干燥,作為保濕劑。
3 總結
嗜鹽菌是極端環(huán)境微生物的重要類群,其深入的研究有利于闡明生物多樣性形成的機制和與極端環(huán)境的適應機制,具有極為重要的科學意義。國內(nèi)外研究內(nèi)容涉及極端嗜鹽菌微生物的資源調(diào)查、物種分析和生化適應分機理研究等,其應用研究主要集中在極端嗜鹽酶類、生物表面活性物質和生物納米材料“紫膜”等方面的開發(fā)利用。近年來,極端微生物分子生物學、基因組學和蛋白質組學等方面亦取得重要進展。嗜鹽菌在高鹽環(huán)境中經(jīng)過長時間的進化,已經(jīng)成功適應了并且依賴上了高濃度鹽環(huán)境,擁有了自己獨有的嗜鹽方法與機制。我們應該加大對嗜鹽菌的研究,從中我們可以發(fā)現(xiàn)很多生命的奧秘,同時可以開發(fā)其用途,進一步造福于人類。
參考文獻
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然而,生命的機制像是一種構件眾多而構造復雜的偶合反應鏈系統(tǒng),如果不能找到對其核心的基因組行之有效的分析技術,科學家們的諸多探索努力也不過零敲碎打、徒勞無功。
如何取得突破?福州大學生物科學與工程學院特聘教授蔡偉文創(chuàng)立福州大學應用基因組學研究所,在攻克世界公認的比較基因組雜交芯片技術后,繼續(xù)帶領團隊,在基因研究這片神秘的天地努力探索。
求學
上世紀80年代,蔡偉文進入中山大學化學系。在那個以陳景潤為科學偶像的火熱年代,更多“天之驕子”愿意選擇數(shù)學、物理專業(yè)。在老師的勸阻中仍然堅定地選擇了化學系,是這個高分考生做出的第一個在人們意料之外的決定?!爱敃r我說不愿意轉到物理系,因為不喜歡隨大流,如果千軍萬馬都去做一件事情,那么也不一定有很多機會?!边@話一出口,周圍人就開始意識到,這個早慧又內(nèi)斂的廣東青年,藏著顆做大事的雄心。
1987年,蔡偉文研究生畢業(yè)后到華南理工大學,擔任化學教師。用他的話來說,這是一段相對沉悶的時光,“不知道往哪兒走。一方面我看到的社會還很落后,很多人需要知識與技術。比如鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)大多是農(nóng)民辦起來的,他們碰到很多技術問題,知識的匱乏會讓人們面對非常簡單的問題束手無策。另一方面,當時的研究體系還沒有深入到為中小企業(yè)服務的程度?!痹趯W校里,蔡偉文是沒有條件做科研的,但他又心有不甘,于是他從工資里面拿錢買試劑做試驗?!耙粋€月工資加補助100多塊錢,勉強支撐”。
留學政策稍微松動了一點,蔡偉文就在講臺上“出走”了,步履匆忙又曲折,但是難以撼動,也就是在此時,他做出了第二個“出格”的專業(yè)選擇:“要去美國留學,我就在想要做什么呢?比我早出去幾年的同行,都繼續(xù)研究化學了,這個學科還是挺成熟的,但我還是想做一些新型研究,希望能有更廣闊的發(fā)展前景,收獲更大?!?/p>
憑著似乎與生俱來的科學敏感度,蔡偉文看到,生物技術未來將大有可為?!爱敃r我對生物技術很感興趣,自己也做了一些基礎學習,感到能有所作為的機會比較多,但是由于我是化學背景,申請不到生物系,所以我就選了一所學校,它的化學系基本上研究生物相關方面的化學,比如蛋白質、核酸DNA這一類的研究。”
入行
1991年年初,蔡偉文獲得獎學金進入美國紐約大學,師從國際知名的基因組分析技術專家David Schwartz教授攻讀博士學位?!皩熓菍8鉊NA研究的,當時就是核酸分析技術,這是分子生物學的一個核心的東西。我選擇他的實驗室時,很多人都勸我說專業(yè)不對口,但我還是去了,而且非常興奮,因為他搞的東西和別的化學研究是不一樣的。”這個在當時看來過于冒險的決定,讓他驚喜萬分。“像一位諾貝爾獎獲得者說的那樣,誰接觸到DNA研究都會發(fā)狂,因為太多的科研方向值得深入研究了?!?/p>
蔡偉文果然“發(fā)狂”了,僅僅半年時間,他就完成了博士階段的課題研究,此后不久,又創(chuàng)立了大分子DNA單分子限制性內(nèi)切酶位點表面固定直接定位方法。這種方法的成功展示確立了DNA單分子物理定位方法的可行性,他的研究成果很快為紐約大學帶來了校史上最大一筆工業(yè)界研究資助――約1500萬美元。
“我的導師原來是搞電泳研究的,他發(fā)明了一種技術,就是脈沖電泳。以前電泳里是通過穩(wěn)壓電壓直流跑,但他改用交替脈沖電流來跑膠,可讓以前無法分離的大片段的DNA分離開。說得形象一點,DNA分子就像劉翔跨欄一樣,凝膠就像是欄,大的跳得慢,小的跳得快,這樣就能夠分開。但是其中有一個問題懸而未決,就是我們的技術不能分離很大的東西,比如很大的核酸,這好比都在高速路上,沒什么欄桿要跨,小車跟大卡車速度其實都差不多。所以,我的導師發(fā)明了一個技術,把它脈沖一下,我讓它跑停、跑停再加速,大的肯定加速就慢,小的就加速快,將分子拉開?!辈虃ノ奶岬剑@項技術非常有用,解決了傳統(tǒng)技術不能解決的很多問題,但是DNA分子為什么能夠分開呢?導師給他布置了“作業(yè)”,成了他的博士論文題目。為了完成研究,蔡偉文決定模仿導師的做法,把整個過程錄下來,把機理展示給人看。當時覺得很難,但事實上,他只用了半年時間,就基本上把過程拍得一清二楚了。
攻克了博士課題,蔡文偉有了更多的空閑時間,實驗室里的其他同事正糾結于大分子DNA內(nèi)切酶切點定位研究。自從1959年美國物理學家費曼在演說中提到,“倘若我們能按意愿操縱一個個原子,將會出現(xiàn)什么奇跡?”操縱單個分子、單個原子就一直是科學家們追求的目標,導師的整個實驗室也都圍繞著相關課題進行研究,眼看著不少同事耗費了大量時間一無所獲,蔡偉文決定另辟蹊徑,“想把內(nèi)切酶定位放置在DNA分子鏈上后做物理圖譜,是比較理想化了,一個小時才盯住看一個分子,基因組大概有兩三萬個片斷,什么時候能把圖譜都做出來。我們不過是要那個信息,完全可以切完以后再去看,不需要將整個酶切過程錄像”。
“我也花了些時間研究DNA怎么粘,不粘DNA怎么把它固定,這個環(huán)節(jié)還不算難,難點在于,你要把DNA分子拉直并固定在表面上,同時酶還能把它切開。沒人這樣做過,我也不知道這樣行不行?!?/p>
又是半年廢寢忘食的反復試驗,內(nèi)切酶弄不開,切不掉,跟死在上面一樣。蔡偉文耗盡了心力,終于發(fā)現(xiàn),如果有足夠的時間,這種思路是完全可行的。大分子DNA單分子限制性內(nèi)切酶位點表面固定直接定位方法一旦取得突破,整個實驗室就活起來了,論文迅速發(fā)表,資金投入進來,目前這項研究成果已經(jīng)應用到儀器上,邁入了商業(yè)化軌道。
立業(yè)
杰出的科研成績,讓蔡偉文順利拿到了博士學位。他又一次走到了專業(yè)選擇的十字路口。
現(xiàn)實又堅硬的社會生態(tài),讓他更清晰地看到了美國城市的叢林法則,“工作崗位并不是一成不變的,競爭性很強,流動性很大,整個社會都在一個不斷優(yōu)化組合的狀態(tài)中。所以我就想,做什么才是最有發(fā)展前景的”。
基因芯片很快吸引了他的注意力。此時,隨著分子生物學相關學科的迅猛發(fā)展,越來越多的動植物、微生物基因組序列得以測定,基因序列數(shù)據(jù)正在以前所未有的速度迅速增長。建立新型雜交和測序方法以對大量的遺傳信息進行高效、快速的檢測、分析就顯得越來越重要。
而基因芯片的檢測原理是核酸雜交方法的微型化,通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列檢定的方法,在一塊基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列,與基因芯片上對應位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時,通過確定熒光強度,獲得樣本中待檢序列完全互補的探針序列的數(shù)量。蔡偉文介紹說,“我感到它特別適合我的研究背景,因為幾年來,我就是在看DNA怎么固定在表面上,而做基因芯片的核心技術就是這樣的。比對了一些已經(jīng)發(fā)表的論文,我感到他們的的核心技術和我們的設想相比,有很大差距,所以就更加有信心了”。
1996年年底,蔡偉文獲得耶魯大學管理的Jane Coffin Childs紀念基金資助,并進入美國貝勒醫(yī)學院分子與人類遺傳系,師從國際知名的轉基因技術專家Allan Bradley教授從事博士后研究。博士后研究期間,他順利開發(fā)出了獨特的生物芯片制備方法并獲得專利,徹底解決了當時基因芯片技術應用中困擾學術界的非特異性表面熒光背景問題。不久之后,在關鍵技術的基礎上,蔡偉文成功開發(fā)出實用的比較基因組雜交芯片技術,成為世界上第一個“吃螃蟹”的人。與此同時,他提出一種了創(chuàng)新的大基因組高效測序策略,并在貝勒醫(yī)學院的人類基因組測序中心得到實施,用于多個基因組的測序項目中。
提及技術突破,蔡偉文中肯地說:“專門想搞技術為生的人非常少,原因有兩個:第一,技術研究難度大;第二,發(fā)表東西十分緩慢,放在當下功利化的評價系統(tǒng)里面,它產(chǎn)出不是很高。我們做技術又經(jīng)常遇到細節(jié)問題,卡在一個環(huán)節(jié)上,就很難推進,但是,如果想做前沿研究就意味著很多東西得從頭做起。咱們中國古話說,工欲善其事,必先利其器。傳統(tǒng)技術3年才能做到的事情,利用新技術可能我們幾個星期就可以完成了,甚至能突破以前沒法做到的事?!?/p>
同樣是在2000年,蔡偉文被貝勒醫(yī)學院分子與人類遺傳系破格提升為終身教職線助理教授并兼任貝勒醫(yī)學院的人類基因組測序中心助理教授,開始主持獨立的實驗室,圍繞獨創(chuàng)的比較基因組雜交芯片技術平臺進行規(guī)?;夹g開發(fā)和應用研究。這個實驗室是全球唯一同時擁有覆蓋人和小鼠的全基因組BAC克隆芯片的實驗室。源于同一技術優(yōu)勢,蔡偉文的實驗室最先觀察到人類和小鼠的基因組中普遍存在的大片段DNA拷貝數(shù)變化的現(xiàn)象。目前對這一現(xiàn)象的研究已成為基因組學研究的一大熱門方向。
豐碩的研究成果,讓蔡偉文成為是國際公認的比較基因組雜交芯片技術的先驅者之一;兩度任加拿大重大基因組項目評審專家;曾主持和參與近十項由美國NIH、NCI、能源部和宇航局資助的研究項目;在權威國際學術雜志發(fā)表48篇具有重要創(chuàng)見的學術論文,已獲得6項美國授權專利,待授權專利多項。
拓路
2011年,蔡偉文受聘為福州大學生物科學與工程學院特聘教授,創(chuàng)立福州大學應用基因組學研究所,主要研究方向是將新一代DNA芯片技術和新的DNA測序技術相結合,對臨床重大難題,如多種癌癥和出生缺陷的基因缺陷特征進行廣泛和深入研究,并致力于將現(xiàn)在國際上的前沿研究成果推向臨床應用。為了加速度搭建國內(nèi)的科研平臺,他又做了一件史無前例的事情,花了數(shù)量可觀的美金將美國實驗室的整套設備自費買出來,以整體平移的方式置入福州大學。
提及這個細節(jié),他說:“我回國的想法很簡單,首先,我的技術在出生缺陷的產(chǎn)前篩查方面有比較好的應用前景。優(yōu)生優(yōu)育是我們國家的一個政策,但說實話,現(xiàn)在并沒有什么特別好的技術。我在研究技術應用的時候,所有的環(huán)節(jié)都是考慮中國如何使用而設定的,如果技術推出去,首先希望造福自己的同胞?!背酥?,蔡偉文還對出生缺陷的相關基因研究十分感興趣。在這一方面,國內(nèi)也可以找到不少罕見的病例。
計算機科學技術的發(fā)展飛快,已經(jīng)漸漸融入人們?nèi)粘I畹狞c點滴滴中,快速發(fā)展中不免有些隱患,因此謹慎分析現(xiàn)狀也是十分有必要的,對計算機科學的進一步發(fā)展也有著積極意義。如今,計算機科學技術作為一個生命力強、發(fā)展前景良好的科學技術,在個人、家庭、企業(yè)乃至國家各個層面區(qū)域的應用都很廣泛,在開發(fā)成本、運行速度以及使用性能等方面都取得了不小的突破。同時,計算機科學的發(fā)展也帶動了集成電路技術、網(wǎng)絡技術、軟件工程、材料科學等領域的快速發(fā)展,各個行業(yè)相輔相成,共同向前進步發(fā)展。在這個信息化的時代,計算機已經(jīng)融入了千家萬戶的生活與工作中,在各個行業(yè)如工農(nóng)業(yè)、文化教育行業(yè)、社會服務業(yè)等之中都發(fā)揮著不可代替的重要作用,對于社會來說已是不可缺少的一部分。其中最重要的則是計算機科學技術在社會生產(chǎn)方面的作用。隨著全球信息化時代的進步,人與人之間、生活與工作之中,信息傳遞是格外重要的。而計算機科學技術則是通過互聯(lián)網(wǎng)的作用改善信息傳遞的方式,加快其速度,從而促進了信息技術行業(yè)的發(fā)展。同時,人們對于信息的認識也與日劇增,從而對信息選擇的要求也越來越高,精確性、有效性、及時性都是人們所追求的目標。由于計算機與網(wǎng)絡的運行形勢,使得人們的勞動方式與工作模式也得到了轉變。秀才不出門,能知天下事。人們可以足不出戶得完成工作與學習任務,節(jié)省了更多人力物力去完成其他的事情,對行動與思想方面也有一定的解放作用。這正是說明了科技乃人類社會第一生產(chǎn)力。另外,計算機科學技術帶動了信息技術的發(fā)展,信息技術也推動著電子技術、生物技術以及新能源新技術的研發(fā)等領域的快速發(fā)展。
2計算機科學技術的發(fā)展前景
2.1生物計算機
早在1994年3月就有一位美國科學家提出了生物計算機這一設想。將DNA堿基序列當做信息的編碼載體,利用當今的分子生物學技術,適當使用控制酶,改變DNA堿基序列并使信息有效反映出來,對數(shù)據(jù)進行運算。DNA計算機設想的出現(xiàn)有效拓寬了人類對計算機了解的視野,改變了計算機僅僅只是簡單是物理性操作的性質,增加了操作方式。如今,英國生物信息研究院的研究人員做出的重大突破使得人們對信息儲存的認識有了進一步的轉變??茖W家們將文學家莎士比亞的154首詩歌的音樂文件(mp3格式)以及相關的照片編制了DNA序列,使得儲存密度大大增高,這一消息使得人們對生物計算機的構想進一步貼近現(xiàn)實。
2.2量子計算機
其特性即原子的同一時間點處于不同位置之間。在數(shù)據(jù)信息處理,數(shù)據(jù)儲存兩方面,量子位的能力較晶體管電子位來說都是存在很大進步的。
2.3光子計算機
光子計算機做出的重大突破即為可以利用光速來完成電子儲存以及運算等工作,與傳統(tǒng)的芯片計算機相比其運行速度大大增加。其實早在20世紀50年代后期就有科學家提出光子計算機這一設想,同時這一設想也在逐漸向現(xiàn)實發(fā)展前進著。1986年,戴維•米勒研制出小型的光開關,使得貝爾實驗室的艾倫•黃研制的光處理器有了一定的基礎,在1990年的1月,光計算機的工作正式開啟。在元器件方面,光計算機有兩種類型,即光電混合型與全光學型。貝爾實驗室成功工作的光計算機采用的就是混合型元器件。然而相比全光學光子計算機,其運行速度還是有些遜色的。要想將全光學光子計算機成功的研發(fā)并制作出,必需研發(fā)出一種特殊的“晶體管”,這種晶體管能夠用一條光來控制另一條光。然而現(xiàn)今存在的光學“晶體管”存在很大的問題,笨拙且較大的體積是無法適用在光子計算機里的。因此,對光子計算機的研發(fā)工作還需要很大的努力,還有很長的一段路要走。
3總結
基因擴增是分子生物學領域的常用研究手段,目前應用最廣的是常規(guī)PCR和real-timePCR技術[1],因其靈敏度高,特異性強,已成為分子生物學領域的關鍵技術。但PCR方法的操作較復雜,對操作人員和儀器設備的要求都較高,不適合基層及現(xiàn)場的快速檢測。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展和改進,新技術不斷涌現(xiàn),TsugunoriNotomi等[2]于2000年提出了LAMP,一種新穎的核酸擴增技術,利用該技術只需在恒溫條件下(60~65℃)保溫幾十分鐘就可快速完成核酸的擴增,無需購置昂貴的PCR儀,操作簡單,快速,可用于現(xiàn)場的快速檢測,近年來已得到廣泛的應用。本文綜述了LAMP技術的基本原理、相對于傳統(tǒng)核酸檢測技術的優(yōu)點、產(chǎn)物的檢測方法及其臨床應用,最后指出LAMP目前存在的不足以及應采取的相應措施,并對其發(fā)展前景進行了展望,從而為LAMP技術在臨床研究上的應用提供參考。
1LAMP法的原理及特點
1.1LAMP引物的設計LAMP技術的核心之一在于引物的設計,因此,設計出特異性強的引物是進行LAMP實驗的首要任務。LAMP引物由一對內(nèi)引物(FIP與BIP)和一對外引物(F3與B3)組成,其中FIP由F1c和F2組成,BIP由B1c和B2組成,嚴格針對靶基因3'端的F1c、F2c和F3c區(qū)以及5'端的B1、B2和B3區(qū)而設計[3],結構組成如圖1所示。
1.2擴增原理DNA在65℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài),此時,任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時,另一條鏈就會解離,變成單鏈[4,5]。據(jù)此,LAMP反應被劃分為2個階段,即起始物合成階段和循環(huán)擴增階段。在第1階段,內(nèi)引物FIP首先與模板F2c區(qū)結合,啟動互補鏈的合成,產(chǎn)生雙鏈DNA。接著,引物F3與F3c互補配對,在BstDNA聚合酶的作用下,啟動鏈置換反應,并釋放出由FIP引導合成的單鏈,此單鏈的5'末端存在互補序列(F1c和F1),于是通過堿基互補配對形成一環(huán)狀結構。以此鏈為模板,與FIP和F3類似,在BIP和B3的作用下,在DN段的另外一端產(chǎn)生了新的環(huán)狀結構,于是整條鏈呈啞鈴狀結構[6],如圖2所示,到此,第1階段反應完成。循環(huán)擴增階段,以啞鈴狀結構為模板,F(xiàn)IP與莖環(huán)區(qū)域F2c雜交,同時,F(xiàn)1c與F1結合,啟動新一輪鏈置換反應,解離出由F1引導合成的雙鏈核酸,并釋放由F2引導合成的單鏈,此單鏈兩端均成環(huán)狀結構,BIP與莖環(huán)區(qū)域B2c互補,啟動新一輪擴增。如此不斷循環(huán),莖的長度和環(huán)的個數(shù)都不斷增加,最后的產(chǎn)物為莖-環(huán)狀DNA與花椰菜狀DNA所組成的混合物。
1.3LAMP技術的優(yōu)點與普通PCR相比,LAMP具有許多優(yōu)點:①特異性強,引物的設計須嚴格針對靶基因的6個區(qū)域,任何一個不匹配就會導致反應無法進行;②靈敏度高,可檢測出1~10拷貝的模板,比PCR高出10倍的檢測限[7];③反應時間短,只需在恒溫條件下保溫30~60min就可完成擴增;④設備簡單,不需要昂貴的PCR儀和特殊的試劑,只需一臺恒溫設備就可進行;⑤產(chǎn)物易檢測,只需用肉眼觀察有無白色渾濁或有無綠色熒光,就可判斷擴增是否發(fā)生。LAMP與普通PCR的比較結果見表1。
1.4LAMP產(chǎn)物的檢測反應結束后,對結果進行判定常用瓊脂糖凝膠電泳檢測、濁度檢測、熒光比色檢測和熒光實時定量檢測
1.4.1濁度檢測隨著核酸的大量生成,溶液中會發(fā)生如下反應:(DNA)n-1+dNTP=(DNA)n+P2O4–7P2O4–7+2Mg2+=Mg2P2O7(白色)由dNTP析出的P2O4-7與溶液中的鎂離子結合,生成肉眼可見的焦磷酸鎂白色沉淀,通過與陰性管比較反應液的渾濁情況,或用濁度儀檢測其在400nm處的沉淀濁度,就可判斷擴增的有無。
1.4.2熒光比色檢測對LAMP產(chǎn)物進行熒光比色檢測時,常用的染料有SYBRGreenⅠ、鈣黃綠素、HNB、溴化乙淀和Picogreen等[8]。其中,SYBRGreenⅠ和HNB的檢測靈敏度最高,是鈣黃綠素的10倍[9],然而SYBRGreenⅠ不能在反應前加入LAMP體系中,否則會抑制反應[10],而反應后加就必須開蓋,又違反了LAMP不開蓋原則,造成氣溶膠污染。HNB則是在反應前加入體系中,避免了開蓋污染的問題,擴增結束后,陽性管呈紫色,陰性管呈天藍色,由此,可判斷靶基因的有無。
2LAMP技術的應用
LAMP技術自2000年開發(fā)以來,因其簡便快速,操作簡單等優(yōu)點,已廣泛應用于細菌、病毒、寄生蟲和動物胚胎性別鑒定等檢測中。
2.1細菌的檢測YoshiteruAoi等[11]利用LAMP對環(huán)境中的氨氧化細菌進行了測定,結果可檢測出10個拷貝數(shù)的DNA,具有與real-timePCR相同的靈敏度,且背景DNA對LAMP的檢測干擾很小,可忽略不計。徐芊等[12]將LAMP用于檢測副溶血弧菌,直接對食品樣品進行檢測,只用一臺恒溫水槽,65℃反應1h,即完成擴增反應,與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比,大大縮短了檢測周期,檢測限達到89cfu/g。葉宇鑫等[13]將原位熒光LAMP技術應用于食品中沙門氏菌的檢測,與傳統(tǒng)沙門氏菌檢測方法和PCR方法相比,原位熒光LAMP無需破碎細胞提DNA,反應方便易行,耗時少;恒溫條件(63℃)下反應,避免了原位PCR方法過高的循環(huán)溫度(95℃)對細胞結構的破壞;在檢測人工污染的樣品時,結果沒有受到雜質的影響,可以檢測到樣本中的單個細胞。張宏偉等[14]以莢膜脂多糖合成調(diào)控子resA為靶基因片段,設計了肺炎克雷伯菌特異性引物,建立了LAMP檢測方法,靈敏度可達2.2~3.4CFU/100g,檢測流程可縮短至2d,比PCR法更加快速。董培陪等[15]結合LAMP與橫向流動試紙條技術(Lateralflowdipstick,LFD)建立起一種鰻利斯頓氏菌快速檢測方法,能在30min內(nèi)完成檢測,靈敏度為7.7cfu/ml,比常規(guī)PCR方法高一個數(shù)量級,通過與橫向流動試紙條檢測技術結合,進一步克服了由非特異性擴增導致的假陽性??梢?,將LAMP技術用于細菌檢測時,其檢測限比常規(guī)PCR更高,與real-timePCR法相比則具有相同的靈敏度,無需分離培養(yǎng)細菌,可直接提取感染動物組織基因組進行擴增[16],操作更為簡單、方便,且不需要昂貴的儀器,該方法有望成為細菌檢測的常規(guī)手段。
2.2病毒的檢測
2.2.1DNA病毒TingCai等[17]利用LAMP方法檢測血清樣本中的HBV,并與real-timePCR法進行了比較,結果表明兩者的檢出率一致,且對于低濃度的樣品,LAMP的準確率更高,更適用于臨床檢測。李明云等[18]根據(jù)對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的結構蛋白VP26基因序列,設計一套引物,建立了針對WSSV的LAMP檢測方法,可檢測到最低模板濃度為0.563pg/μl,靈敏度比常規(guī)PCR法高1個數(shù)量級,并且當模板濃度由10-5倍稀釋到10-6倍時,PCR產(chǎn)物濃度顯著降低,受模板濃度的影響較大,而LAMP的擴增產(chǎn)物濃度則基本不受影響。張侃等[19]將LAMP用于偽狂犬病病毒的檢測,在45min內(nèi)完成檢測,其特異性與PCR方法一致,敏感性則是PCR的100倍,最低能夠檢測10個拷貝的目的基因。
2.2.2RNA病毒LeoL.M.Poon等[20]于2004年首先建立了針對SARS的RT-LAMP技術,通過對31例SARS患者的檢測,檢出率為64%,其靈敏度略低于實時PCR,但是比常規(guī)PCR法更高。TetsuoYoneyama等[21]用RT-LAMP法檢測了糞便中的HAV,實驗中加入了環(huán)引物,將檢測時間縮短至50min,與RT-PCR法(需要2~3h)相比大大節(jié)省了時間;對HAV實驗室病毒毒株的檢測,靈敏度為0.4~0.8FFU/5μl,與侵染性實驗法相當,且能檢測到HAVⅢ型,比real-timeRT-PCR法的檢測范圍更廣,可作為基層疫情監(jiān)控的常規(guī)檢測方法。聶凱等[22]采用一步法的RT-LAMP檢測人甲型H1N1流感病毒基因,在反應體系中直接加入反轉錄酶,大大簡化了LAMP技術用于RNA病毒檢測的操作步驟。此外,LAMP技術在檢測艾滋病病毒[23]、鵝細小病毒[24]、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒[25]、人星狀病毒[26]、單純皰疹病毒Ⅰ型[27]、豬圓環(huán)2型病毒[28]等方面均有報道,無論是DNA還是RNA病毒LAMP都能做到快速檢測,在檢測RNA病毒時更是省去了RT-PCR法中費時的反轉錄步驟,在臨床檢測上顯示出越來越重要的地位。
2.3寄生蟲的檢測HiromiIkadai等[29]將LAMP法用于巴貝斯蟲的檢測,證實LAMP具有與PCR和光學顯微鏡同樣的敏感性,而且更加簡便,快速。李群等[30]為提高牛巴貝斯焦蟲病的檢出率,采用LAMP法進行了檢測,結果表明,LAMP檢測體系特異性強,與雙芽巴貝斯焦蟲DNA不發(fā)生交叉反應;敏感性高,最小檢測值為0.014fg,為一般PCR法的103倍。Jun-HuChen等[31]用LAMP法對間日瘧感染患者進行診斷,在117例鏡檢呈陽性的血清樣本中,LAMP檢出115例,靈敏度和特異性與鏡檢法和nestedPCR法相近,但是操作更加簡單,不需要昂貴的儀器,且對DNA的抽提要求不高,有望成為檢驗科或瘧疾診所的常規(guī)診斷方法。
2.4動物胚胎性別的鑒定LAMP在動物胚胎性別的鑒定方面也有應用,HirokiHirayama等[32]首次利用LAMP法檢測牛胚胎的性別,鑒定的準確率為88.9%~94.4%,整個鑒定過程不超過1h。KhairyM.A.Zoheir等[33]也成功將LAMP用于牛胚胎性別的鑒定,以EB和CuSO4為指示劑,反應45min即可通過肉眼觀察顏色的變化,從而鑒定出雌雄,準確率達100%,簡單快速,成本低,可用于養(yǎng)殖場現(xiàn)場操作。
3不足與對策
3.1存在的不足對擴增產(chǎn)物定量檢測時,需要購置昂貴的熒光定量PCR儀或濁度儀;LAMP法的擴增靶序列長度控制在300bp以下,對引物要求高,由在線軟件設計的引物有上千條,要篩選出合適的引物需要耗費大量的工作;LAMP靈敏度高,一旦開蓋容易形成氣溶膠污染;傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物的電泳圖都是呈現(xiàn)單帶,而LAMP法陽性反應則是呈階梯狀條帶,因此,若有非特異性擴增的產(chǎn)生,則不易辨別,造成LAMP容易出現(xiàn)假陽性。
3.2對策嚴格做好防污染工作,體系的配制一定要在超凈臺內(nèi)進行,實驗器材要進行消毒滅菌;BstDNA酶最后加入體系,若有必要可以在體系上覆蓋一層礦物油;LAMP體系的配制和檢測必須要嚴格分區(qū),操作人員往返兩區(qū)域進行實驗時要更換實驗服,同時要盡可能地避免無關緊要的人員流動,凡進入檢測區(qū)的實驗器材都不要再拿回配制區(qū)。由于開蓋檢測容易造成氣溶膠污染,所以反應結束后最好不要打開PCR管,可采用反應前加入HNB染料的方法對擴增產(chǎn)物進行定性檢測。一旦出現(xiàn)污染,應立即停止實驗,每天給實驗室通風,給超凈臺紫外滅菌并通風,一段時間后更換所有試劑再做。采用HidenoriTani等[34,35]提出的ABC-LAMP技術對LAMP產(chǎn)物進行定量,該方法主要是在反應體系中加入探針AB-QProbe和已知濃度的內(nèi)標,探針的熒光值代表靶基因與內(nèi)標的比值,隨著反應的進行,靶基因與內(nèi)標被同等程度擴增,通過測定反應終點兩者的熒光值之比,結合內(nèi)標的初始濃度就能對初始模板定量,從而實現(xiàn)了以較低的成本對產(chǎn)物的定量檢測。