淺說對生長因子與口腔黏膜的研究

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1實(shí)驗(yàn)

無菌條件下取行智齒拔除術(shù)或牙齒助萌術(shù)患者健康牙齦組織，PBS(pH=7.4)徹底沖洗后，加入Dispase溶液2.0-3.0mL，4℃條件下消化過夜；次日，終止消化后，用眼科鑷將組織的表皮層與真皮層分離，將真皮層組織剪碎后，加入0.1%Ⅰ型膠原酶2.0-3.0mL，37℃條件下間斷震蕩消化3h，PBS終止消化后，過篩，1000r/min離心5min后，棄上清，用細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM+體積分?jǐn)?shù)10%血清+1%雙抗)重懸細(xì)胞，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)三四天，細(xì)胞貼壁后換液，以后每兩三天換液1次，待細(xì)胞融合達(dá)到70%-80%時(shí)，傳代擴(kuò)增。脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定：無菌條件下取本院整形外科20-30歲吸脂患者的皮下脂肪5-10mL，PBS徹底沖洗，剔除血管和筋膜后剪碎，0.1%Ⅰ型膠原酶37℃水浴消化，20-30min后終止，過篩、離心后用人脂肪干細(xì)胞的專用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于25mm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件同前。待細(xì)胞傳至第3代時(shí)，做流式鑒定(選取的表面標(biāo)志為CD13，CD14，CD44，CD90，CD105，CD34)和多向誘導(dǎo)分化，成脂誘導(dǎo)14d后，油紅O染色；成骨誘導(dǎo)14d后，茜素紅染色；成神經(jīng)元誘導(dǎo)7d后甲苯胺藍(lán)染色。脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液的制備及蛋白芯片分析：選擇生長良好的第3代脂肪干細(xì)胞，待細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，換無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，收集上清，1000r/min離心5min，保留上清，0.22μm濾膜過濾，分裝，-80℃凍存?zhèn)溆?。?mL脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液，采用蛋白芯片法對其蛋白含量進(jìn)行檢測分析，此法可針對507種細(xì)胞因子的含量進(jìn)行定性及半定量檢測，檢測步驟及分析方法參考RayBioBiotinLabel-basedHumanAntibodyArrayI說明書(Cat#:AAH-BLM-1-2)。

脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子及堿性成纖維細(xì)胞生長因子對口腔黏膜成纖維細(xì)胞增殖的影響：選擇第3-5代口腔黏膜成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞融合達(dá)到70%-80%時(shí)，胰酶消化1min，終止消化后將細(xì)胞制成濃度為5×107L-1的細(xì)胞懸液，種于96孔板中(100μL/孔)，約4h待細(xì)胞貼壁后換液，分別設(shè)陰性對照組(DMEM/F12)、空白對照組(脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液)、血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子以及堿性成纖維細(xì)胞生長因子3種因子的濃度梯度實(shí)驗(yàn)組(脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液+1，10，20，50，100μg/L質(zhì)量濃度的因子)，以及分別加入各上述因子中和抗體的實(shí)驗(yàn)組(脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液+中和抗體)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。采用CCK-8法，用酶標(biāo)儀在光波波長為450nm的條件下，分別于1，2，3，4，5d檢測各組的吸光度值(A)，比較在對數(shù)生長期(第3天)時(shí)各濃度梯度下血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子以及堿性成纖維細(xì)胞生長因子3種因子對口腔黏膜成纖維細(xì)胞增殖的影響。主要觀察指標(biāo)：①脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液蛋白芯片分析結(jié)果。②脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子以及堿性成纖維細(xì)胞生長因子對口腔黏膜成纖維細(xì)胞增殖的影響。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x_±s表示，趙佳佳和胡麗應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對資料進(jìn)行分析。多組間差異比較用方差分析，兩組間差異比較用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著性意義

2結(jié)果

2.1細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

口腔黏膜成纖維細(xì)胞扁平，呈梭形，脂肪干細(xì)胞原代接種后，由短梭形和多角形逐漸變?yōu)殚L梭形流式檢測結(jié)果顯示人脂肪干細(xì)胞高表達(dá)CD13(99.49%)，CD44(92.13%)，CD90(97.78%)，CD105(96.82%)，而低表達(dá)CD14(1.14%)，CD34(2.71%)。脂肪干細(xì)胞成脂、成骨及成神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)及鑒定結(jié)果

2.2脂肪干細(xì)胞條件

培養(yǎng)液蛋白芯片分析結(jié)果檢測脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中507種因子的信號(hào)平均值見表1，其中血管內(nèi)皮生長因子(信號(hào)值SV=360.5)、血小板源性生長因子(信號(hào)值SV=363.5)以及堿性成纖維細(xì)胞生長因子(信號(hào)值SV=389.5)信號(hào)平均值均大于300，與陰性對照組比較差異有非常顯著性意義(P<0.001)。

2.3脂肪干細(xì)胞條件

培養(yǎng)液中血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子以及堿性成纖維細(xì)胞生長因子對口腔黏膜成纖維細(xì)胞增殖的影響結(jié)果顯示，脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液對口腔黏膜成纖維細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用，差異有顯著性意義(P≤0.05)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中，血小板源性生長因子以及堿性成纖維細(xì)胞生長因子對成纖維細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用，且隨著因子濃度的增高而呈現(xiàn)峰值性改變，其中堿性成纖維細(xì)胞生長因子對成纖維細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用在1μg/L時(shí)即達(dá)到了峰值，且在脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子的中和抗體后，明顯抑制了脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液對成纖維細(xì)胞的增殖作用血小板源性生長因子對成纖維細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用在50μg/L時(shí)達(dá)到了峰值，且在脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中加入血小板源性生長因子的中和抗體后，也可明顯抑制脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液對成纖維細(xì)胞的增殖作用，差異有顯著性意義(P≤0.05)；而血管內(nèi)皮生長因子對成纖維細(xì)胞的增殖并沒有明顯的促進(jìn)作用，且在脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中加入血管內(nèi)皮生長因子的中和抗體后，也沒有明顯抑制脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液對成纖維細(xì)胞的增殖作用

3討論

在正常的生理情況下，口腔黏膜相對于皮膚而言，具有創(chuàng)傷后愈合快，形成瘢痕組織少的特點(diǎn)。然而，在一些病理?xiàng)l件下，如復(fù)發(fā)性阿弗他口腔潰瘍，口腔黏膜大面積缺損等臨床病例中，由于全身因素及細(xì)胞所處的微環(huán)境等條件的改變，如嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)等，黏膜的愈合能力受到了限制，創(chuàng)面愈合延遲，且更易形成瘢痕組織。值得關(guān)注的是，脂肪干細(xì)胞除了具有易于分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增，免疫調(diào)節(jié)性，可以被反轉(zhuǎn)錄病毒高效轉(zhuǎn)染等其他成體干細(xì)胞所不能比擬的優(yōu)越性能之外，脂肪干細(xì)胞有向炎癥和受損組織部位歸巢的特性，而其分泌的細(xì)胞因子也可以為受損組織提供營養(yǎng)支持。因此，實(shí)驗(yàn)通過研究脂肪干細(xì)胞分泌的生長因子對口腔黏膜成纖維細(xì)胞增殖的影響，從一方面證實(shí)了其對口腔黏膜創(chuàng)傷修復(fù)的促進(jìn)作用，為脂肪干細(xì)胞及其分泌的生長因子在口腔黏膜創(chuàng)傷修復(fù)中的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液對口腔黏膜成纖維細(xì)胞遷移具有明顯的促進(jìn)作用，為了探究脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的因子種類，本實(shí)驗(yàn)對脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液進(jìn)行了蛋白芯片分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)量較高(>300倍)的57種相關(guān)活性因子中(數(shù)據(jù)未顯示)，有的因子對血管再生具有明顯的促進(jìn)作用，如血管生成素1，4、內(nèi)皮素、血小板反應(yīng)蛋白以及白細(xì)胞介素22等；有的因子，包括血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子、表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、巨噬細(xì)胞刺激蛋白等在內(nèi)，對與創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)的效應(yīng)細(xì)胞的遷移和增殖具有明顯的促進(jìn)作用，利于血管形成以及上皮再生；除此之外，這次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中還具有一些特殊效應(yīng)的因子，如外異蛋白A2，該因子是腫瘤壞死因子家族的成員之一，與外胚層器官，尤其是皮膚附屬器，如毛囊、汗腺的發(fā)育密切相關(guān)。

上述結(jié)果證實(shí)，脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中含有多種脂肪干細(xì)胞分泌的，與創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)的生物活性因子，各種因子共同作用，在創(chuàng)傷修復(fù)的各個(gè)階段，促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合。為了進(jìn)一步探究脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液在創(chuàng)傷修復(fù)過程中對口腔黏膜成纖維細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制，這次實(shí)驗(yàn)選擇血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子，這3種與細(xì)胞增殖及遷移密切相關(guān)且在脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中高表達(dá)(>300倍)的細(xì)胞因子，分別檢測其對口腔黏膜成纖維細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血小板源性生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子對成纖維細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用，且隨著因子濃度的增高而呈現(xiàn)峰值性改變，其中堿性成纖維細(xì)胞生長因子對成纖維細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用在1μg/L時(shí)即達(dá)到了峰值，血小板源性生長因子對成纖維細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用在50μg/L時(shí)達(dá)到了峰值，且分別在脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中加入兩者的中和抗體圖8血小板源性生長因子對口腔黏膜成纖維細(xì)胞增殖的作用Figure8Effectofplatelet-derivedgrowthfactorontheproliferationoforalmucosafibroblasts1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10A空白對照組與空白對照組比較，aP<0.05。注：血小板源性生長因子對成纖維細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用在50μg/L時(shí)達(dá)到了峰值，且在脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中加入血小板源性生長因子的中和抗體后，也可明顯抑制脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液對成纖維細(xì)胞的增殖作用。中和抗體組aaa1102050100堿性成纖維細(xì)胞生長因子(μg/L)圖9血管內(nèi)皮生長因子因子對口腔黏膜成纖維細(xì)胞增殖的作用Figure9Effectofvascularendothelialgrowthfactorontheproliferationoforalmucosafibroblasts1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10A空白對照組注：血管內(nèi)皮生長因子對成纖維細(xì)胞增殖沒有明顯的促進(jìn)作用，且在脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中加入血管內(nèi)皮生長因子的中和抗體后，也沒有明顯抑制脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液對成纖維細(xì)胞的增殖作用。中和抗體組1102050100堿性成纖維細(xì)胞生長因子(μg/L)后，脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液對成纖維細(xì)胞增殖的作用得到了顯著的抑制，結(jié)果有顯著性差異(P≤0.05)。

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然血小板源性生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子對成纖維細(xì)胞的增殖具有明顯促進(jìn)作用，但是有各自的適宜濃度，高濃度的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(≥20μg/L)和低濃度的血小板源性生長因子(≤20μg/L)對成纖維細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用并不是很明顯。上述結(jié)果提示，在脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中，對成纖維細(xì)胞的增殖具有明顯促進(jìn)作用的因子可能為血小板源性生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子，且這種作用對因子的濃度具有依賴性和適宜性。堿性成纖維細(xì)胞生長因子是一類研究比較成熟的生長因子，在體內(nèi)外均可表現(xiàn)出廣泛的生物學(xué)活性。堿性成纖維細(xì)胞生長因子來源于成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，其基本生物學(xué)作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖,可增強(qiáng)有絲分裂活性。大量體外及體內(nèi)研究證實(shí)，組織損傷后，局部堿性成纖維細(xì)胞生長因子表達(dá)增加，通過趨化作用使炎癥細(xì)胞，成纖維細(xì)胞等向損傷部位聚集，同時(shí)通過促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞增殖，遷移，促進(jìn)血管及肉芽組織的形成，從而促進(jìn)損傷修復(fù)與重建。除此之外，近年來，越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道，在口腔中，堿性成纖維細(xì)胞生長因子對牙周膜組織中的成纖維細(xì)胞及牙髓細(xì)胞均具有促進(jìn)其增殖和遷移的作用。

大量研究證實(shí)，血小板源性生長因子可由多種細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞、炎癥細(xì)胞等分泌合成，其在體內(nèi)體外均具有豐富的生物學(xué)活性，與創(chuàng)傷修復(fù)過程有密切的聯(lián)系，其中，一個(gè)重要的機(jī)制即促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移。近年來，亦有研究證實(shí)，在口腔中血小板源性生長因子具有促進(jìn)牙齦及牙周膜組織中成纖維細(xì)胞增殖和遷移的作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在創(chuàng)傷修復(fù)的早期階段，可以通過調(diào)節(jié)脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中因子種類，并適當(dāng)選擇和提高脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中血小板源性生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子等細(xì)胞因子的濃度，從而促進(jìn)口腔黏膜成纖維細(xì)胞增殖，將利于脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液在創(chuàng)傷修復(fù)中的應(yīng)用。血管內(nèi)皮生長因子屬于血小板源性生長因子/血管內(nèi)皮生長因子家族，主要作用于內(nèi)皮細(xì)胞，相關(guān)研究證實(shí)，血管內(nèi)皮生長因子具有提高血管滲透性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長和遷移，抑制細(xì)胞凋亡等生物學(xué)活性，從而可以促進(jìn)血管的發(fā)生和生成，在創(chuàng)傷修復(fù)過程發(fā)揮重要的作用。然而，本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子對成纖維細(xì)胞增殖并沒有顯著的促進(jìn)作用，上述結(jié)果提示，黏膜成纖維細(xì)胞的增殖很可能并不是由血管內(nèi)皮生長因子進(jìn)行調(diào)節(jié)的。

4結(jié)論

綜上所述，在創(chuàng)傷修復(fù)過程中，脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液可以促進(jìn)口腔黏膜成纖維細(xì)胞的增殖，且脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中的多種生物活性因子可以共同促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)，因此，相較于單一應(yīng)用的商品化生產(chǎn)的細(xì)胞因子，脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液更具有其臨床應(yīng)用前景。然而創(chuàng)傷修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，血管內(nèi)皮生長因子、血管源性生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子對成纖維細(xì)胞增殖的作用機(jī)制仍需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證；另外，脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中其他因子對創(chuàng)傷修復(fù)的作用及其作用機(jī)制仍將是后續(xù)的研究方向。

作者：趙佳佳 胡麗 劉加榮 宮妮雅 陳莉莉 單位：華中科技大學(xué)