食源性微生物MRSA食品安全論文

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1 食品安全與超級細菌       

1.1 超級細菌

2010 年《柳葉刀》雜志首次報道南亞的 “超級細菌”，該菌攜帶具有泛耐藥性 NDM-1 基因，能對絕大多數(shù)抗生素耐藥；經(jīng)進一步研究發(fā)現(xiàn)，英國衛(wèi)生部和美國疾控中心均提出攜帶 NDM-1 基因的細菌具有大范圍傳播和感染能力。目前，NDM-1 耐藥菌在印度腸細菌感染中達 1%-3%；在歐洲、非洲和澳大利亞等地亦已有報道；我國在 2011 年首次發(fā)現(xiàn)該類耐藥細菌，可見其感染范圍和感染率呈擴增趨勢。耐藥性不改變致病菌的性狀，但可讓患者在感染后變得無藥可治。臨床微生物學傳統(tǒng)定義的“超級細菌”包括臨床上出現(xiàn)的多種耐藥菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、抗萬古霉素腸球菌（VRE）以及耐多藥肺炎鏈球菌（MDRSP）等。與 NDM-1 耐藥菌相比，這些傳統(tǒng)的“超級細菌”檢出率更高，在感染性疾病中更多見；其中，MRSA 是醫(yī)院內(nèi)最常見的病原菌之一，具有高發(fā)病率。據(jù)美國 CDC 統(tǒng)計，每年約數(shù)十萬人因感染 MRSA 而住院治療，院內(nèi)感染的 MRSA 分離率已高達 80%以上，其多重耐藥的特性不但增加了治療的復雜性和難度，也增加了抗生素的消耗量和醫(yī)療費用。

1.2 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是主要的食源性微生物，由其引起的食品中毒事件在革蘭氏陽性菌中高居首位；據(jù)統(tǒng)計，在美國，由金葡菌引起的食物中毒占 33%，僅次于大腸桿菌；在 1983-1997 年間，每年約 18.5 萬人發(fā)生葡萄球菌中毒，其中 1750 人住院，總醫(yī)療費用達 15 億美元。金葡菌在加拿大占細菌性食物中毒的 45%，而在某些歐洲國家如匈牙利、芬蘭等則占 50%以上。在日本，1980-1999 年間共超過2500 起葡萄球菌中毒報道，受感染人數(shù)約 6 萬人；而 2000 年因污染金葡菌引起的“雪印奶粉”事件則超過 14000人受感染。在我國，每年由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件也是屢見不鮮。金葡菌也是典型的耐藥微生物，是潛在的“超級細菌”。1961 年 Jevons 在英國首次發(fā)現(xiàn)對甲氧西林耐藥的金葡菌（mrsa），MRSA 在 20 世紀 60 年代中期擴展至歐洲及北美等地區(qū)，逐漸成為世界范圍內(nèi)的主要醫(yī)院獲得性病原體；在 70 年代末急劇增多并遍及全球，其引起的感染性疾病與乙型肝炎，艾滋病同為當今世界三大感染頑疾[15,16,19,20]。；而從 90 年代開始，MRSA 更突破了以往在醫(yī)院中檢出的局限，進一步在社區(qū)中被大量檢出，其菌株與耐藥特點也隨之發(fā)生變化。

1.3 MRSA的耐藥性

MRSA 從首次發(fā)現(xiàn)至今 50 余年中，其耐藥范圍不斷擴大，耐藥程度也日益嚴重。上世紀 80 年代，慶大霉素是一般治療 MRSA 感染的有效藥物，而目前 MRSA 對其耐藥率已超過 50%；同期，MRSA 對曾經(jīng)的保留用藥氟喹諾酮類藥物高度敏感，但當前 80%以上的 MRSA 對其耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，MRSA 耐藥的主要原因是其攜帶的 mecA 基因編碼的一種對 β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物具低親和力的青霉素結合蛋白 PBP2a；mecA 是一個外源基因，來自凝固酶陰性葡萄球菌或腸球菌屬，通過轉座子或 R 質(zhì)粒轉到原本敏感的金葡菌中，并整合在染色體第 10 節(jié)段上，該基因組島被稱為葡萄球菌染色體盒（SCCmec）。PBP2a 蛋白分子量為 78kD，當金葡菌固有的 PBPs 被 β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物結合失活后，PBP2a 能替代其發(fā)揮轉肽酶的功能，促進細胞壁合成，從而產(chǎn)生耐藥性[22]。根據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）標準，金葡菌在檢出 mecA 基因或者 PBP2a蛋白時即可定義為 MRSA；但菌株的耐藥程度有所差異，其主要包括兩大類：相對敏感型菌株和高度耐藥型菌株。在培養(yǎng)基鑒定菌株耐藥時，為克服表型的異質(zhì)性，傳統(tǒng)方法采用不易降解，MRSA 異質(zhì)性相對較低的苯唑西林，通過適當培養(yǎng)條件如在 30℃或 35℃培養(yǎng)，提高培養(yǎng)基 NaCl 濃度 ( 2 %～4 %)，強化耐藥性表達，延長培養(yǎng)時間，來提高準確性[24]。近年來，新型耐藥整合子元件在 MRSA 中大量發(fā)現(xiàn)，成為 MRSA 耐藥性發(fā)展的新特點。整合子是一種存在于細菌質(zhì)?；蛉旧w上具有移動性的基因捕獲和表達的遺傳單位，在革蘭氏陰性菌中被廣泛報道，介導對多種抗生素的耐藥性，成為革蘭氏陰性菌中耐藥性泛濫的主要原因[25-28]。然而在革蘭氏陽性菌中一直鮮有報道。筆者根據(jù)對 2001 年-2006 年間華南地區(qū)的 MRSA 耐藥性研究表明[5,6,29-32]，第一類整合子在 MRSA 中普遍存在，但分離率低于常見報道的革蘭氏陰性菌，為 46.6%（122/262），遠低于常見院內(nèi)感染微生物如銅綠假單胞菌（一般報道為 80%以上）等；同時，前期研究顯示，第一類整合子系統(tǒng)存在與否，對紅霉素、慶大霉素、四環(huán)素和甲氧芐啶-磺胺甲唑等抗生素的耐藥性具有顯著影響。然而，這些抗生素均具有較長的歷史，并非治療 MRSA 感染的常用藥物，甚至多年前已退出醫(yī)院常用藥物行列。例如，四環(huán)素自 1948 年問世至今超過 60 年，是應用最多、最廣泛的廣譜抗菌素；后來發(fā)現(xiàn)其對牙齒、指甲與鞏膜等具有嚴重副作用，隨后在臨床使用中逐漸淘汰。慶大霉素同樣由于具有較大副作用在多年前已退出治療的一線藥物。因此，近年來流行MRSA 中出現(xiàn)的對這些抗生素耐藥性可能不由臨床環(huán)境中抗生素選擇壓力所產(chǎn)生。可能由于這些藥物在畜牧業(yè)中仍被大量應用，因此在 MRSA 中出現(xiàn)的對這些藥物的耐藥性，這也暗示了畜牧業(yè)中抗生素的濫用造成了微生物在向“超級細菌”進化，這已經(jīng)成為食品安全中的一個重要的潛在問題。

2 MRSA的檢測

常規(guī)方法對 MRSA 的檢測包括：苯唑西林紙片擴散法，乳膠凝集試驗和苯唑西林瓊脂篩選方法。最近，臨床和實驗室標準化研究所（CLSI）推薦使用的頭孢西丁紙片擴散法檢測 MRSA[33]，以及還有一些其他的檢測方法。常規(guī)培養(yǎng)液檢測方法通常具有很高靈敏度，但是對于此方法高的靈敏度伴隨的是檢測速度相對比較慢。

2.1 紙片擴散法

紙片擴散法包括苯唑西林和頭孢西丁紙片擴散法，其步驟一般包括制備菌液、接種平板、貼藥敏紙片、培養(yǎng)等。前者把菌株在 1μg 苯唑西林 MH 瓊脂培養(yǎng)基進行試驗，抑菌圈在 35℃經(jīng)過 24 小時培養(yǎng)確定；其抑菌圈大小是根據(jù) CLSI（2008）的標準進行判斷:抑菌環(huán)直徑≤10 mm 為耐藥，11-12 mm 為中介，≥13 mm 為敏感；當抑菌圈直徑在 11～12 mm 時判斷為中間，需加做 mecA 或 PBP2a 的檢測以證實是否為 MRSA。該方法最大優(yōu)點是快速、簡便、價格便宜，易被檢驗人員接受。在合適的抗生素、pH、及培養(yǎng)溫度、菌液的濃度、培養(yǎng)基厚度等條件下，該方法檢測 MRSA 是可行的。它對 MRSA 檢出敏感性、特異性較高，仍不失為目前臨床微生物實驗室常規(guī)篩檢 MRSA 方法之一。但由于多種因素的影響，從表型上進行診斷，其結果略欠準確，致使其特異性低于其他方法。許多研究均發(fā)現(xiàn)頭孢西丁紙片法相比于苯唑西林紙片法具有更好的靈敏度[34-36]。該法把菌株在帶有 30μg 的苯唑西林 MH 瓊脂培養(yǎng)基進行試驗，抑菌圈是 35℃經(jīng)過 16-18 小時培養(yǎng)確定：根據(jù)CLSI（2008）標準：抑菌環(huán)直徑≤21 mm 為耐藥，≥22 mm 為敏感。該方法優(yōu)點同樣是快速、簡便、價格便宜，并且靈敏度高于苯唑西林紙片法。Priya Datta[32]等發(fā)現(xiàn)，頭孢西丁的紙片法具有 98.5％的靈敏度和 100%的特異性，而苯唑西林紙片法的是 91.4%的靈敏度和 99.2%的特異性。但是作為 CLSI 所推薦的標準，在檢測 MRSA時如果與一些其它方法補充可以不會有 MRSA 的漏檢。苯唑西林紙片擴散法對于 MRSA 異質(zhì)性耐藥檢測較為困難，而頭孢西丁能誘導 mecA 基因表達 PBP2a，能更好地檢出異質(zhì)性耐藥菌株。

2.2 苯唑西林瓊脂篩選

MH 培養(yǎng)基加 NaCl(40 g/L)加苯唑西林(6 μg/ml)，將菌液(0.5 麥氏濁度)畫線在培養(yǎng)皿上 35°C 培養(yǎng) 24 h，只要平皿有菌生長，即使是一個菌落也判斷為 MRSA，敏感度為 100%。與常規(guī)方法相比在 MRSA 檢測上并無顯著性，但對于其它葡萄球菌，瓊脂篩選法有較高的陽性率，因此尤其適用于多種葡萄球菌中 MRSA 的檢測。該法操作方法簡便、實驗成本低，一個平板可同時檢測多個樣品，檢出率高，較為實用，可用于 MRSA的常規(guī)檢測；尤其當多種檢測方法結果不一致時，應以瓊脂篩選為準。但是該法耗時長，此外 Swenso 等發(fā)現(xiàn)在異質(zhì)耐藥菌株進行試驗時該方法敏感性下降，特異性降低且出現(xiàn)邊緣性MIC；Diedere等發(fā)現(xiàn)CHROM瓊脂篩選具有 97.1%的敏感性和 99.2%的特異性，如果篩選周期到由 24 小時變?yōu)?48 小時，菌落敏感性將會增加到 100%。

2.3 乳膠凝集試驗

凝集試驗是一種快速、操作簡便的免疫學診斷方法，在臨床快速 MRSA 診斷方面應用廣泛。其原理是抗 PBP2a 單克隆抗體致敏的乳膠顆粒與 MRSA 的膜蛋白提取物作用，如產(chǎn)生肉眼可見的凝集顆粒證實有PBP2a 存在，判斷其為 MRSA。其它還有一些檢測存在于細胞膜內(nèi) PBP2a 的乳膠試劑，這類檢測需要裂解細胞。代表的試劑盒包括 PBP2’Test（Oxoid）、MASTALEX -MRSA（Mast）和 MRSAScreen（Denka Seiken）。研究表明該方法的敏感性≥97%[41-43]，而 Datta 等[36]報道其具有 100%的敏感性和 99.2%的特異性。同時，該方法具有與 mecA 基因檢測相關性好、快速簡便、特異性強、靈敏度高等特點，且不需特殊儀器和技術，尤其適合用于 MRSA 早期檢測，可作為 PCR 法的替代方法；但檢測成本較高。

2.4 分子生物學診斷方法

自上世紀90年代起，分子生物學方法在微生物檢測中逐漸取代傳統(tǒng)方法，主要包括PCR、熒光定量PCR與各種新型核酸擴增技術等。與常規(guī)“金標準”方法相比，PCR技術具有較大優(yōu)勢。首先，在耗時方面，由于常規(guī)方法基于細菌培養(yǎng)，因此增菌以及選擇性培養(yǎng)耗時可長達3天，但PCR由于檢出限低，樣品中微量的菌體足以啟動擴增反應，因此在從樣品處理到培養(yǎng)的時間可大為縮減。由于PCR具有高特異性，因此以上方法的增菌與細菌培養(yǎng)（LB培養(yǎng)基）階段，與“金標準”相比，耗時可降低12-24h。其次，細菌鑒定操作方面，“金標準”方法在細菌培養(yǎng)后，常需通過血漿凝固酶實驗鑒定，而PCR通過選取特異的分子靶點，結果特異性高；該方法在鑒定金葡菌特異基因的同時，以所有葡萄球菌的靶點為內(nèi)參，可信度更高。

再次，PCR方法的高靈敏度和特異性，有助于解決“金標準”方法中假陰性和低敏感度的問題。筆者等以orfX為檢測靶點，建立針對MRSA的檢測方法，該方法已被證明是一個簡單，快速，特異，敏感的檢測方法，對于食品檢測，醫(yī)院等機構對MRSA快速鑒定具有重要意義，在未來發(fā)展中對簡化檢測方法的改進具有深遠的意義。此外，筆者等[44]建立的多重PCR體系，針對16SrRNA、femA和mecA基因，可用于MRSA檢測。除具有常規(guī)PCR的優(yōu)點外，多重PCR能在同一次PCR反應和凝膠電泳分析中，完成多個靶基因的檢測，在簡便性、耗時方面具有較大優(yōu)勢；本實驗建立的多重PCR方法，結果證實其能對葡萄球菌、金葡菌及關鍵耐藥因子進行檢測與鑒定。該方法特異靈敏、簡便快捷，同時具有適應面廣，易于推廣和應用等優(yōu)點。1995年出現(xiàn)的以標記特異性熒光探針為特點的熒光定量PCR技術，實行完全閉管式操作，不僅能大大減少擴增產(chǎn)物的污染機會，提高檢測的特異性，且可通過計算機自動分析對擴增產(chǎn)物進行精確定量提高檢測的靈敏度，完全克服了普通PCR的缺點，且該方法操作簡便迅速，適用于大樣本量的篩查該方法可用于檢測葡萄球菌及腸毒素。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測技術相比，分子檢測技術能夠對食品中有害微生物實現(xiàn)快速、準確的檢測；與普通的PCR相比，實時熒光定量PCR可以在PCR反應過程中直接檢測熒光信號，無需配膠、電泳等步驟，可以更加快速有效地鑒別出MRSA，且可以對靶位基因進行定量檢測。Warren等[45]通過特定目標的一種熒光分子信標探針與擴增產(chǎn)物雜交，用實時熒光PCR法直接從鼻咽拭子標本中快速檢測MRSA，其敏感性為91.7％，特異性為93.5％，82.5％能顯示陽性，97.1％能顯示陰性，其中拭樣處理和檢測時間僅為1.5小時。

Oh等通過Xpert MRSA檢測體系，在2小時內(nèi)完成MRSA檢測；Xpert MRSA測試法是一種快速，敏感，臨床上有用的檢測方法，利用SCCmec上一段特異性序列，特別適用于早期MRSA的檢測。Liu等[47]通過使用一種新的集成微流體系統(tǒng)可以檢測活MRSA、敏感金葡菌和其它病原體，該微流體系統(tǒng)已被證明具有100％的MRSA檢測特異性；從樣品預處理到熒光觀察，可自動化在2.5小時內(nèi)完成。Stenholm等[48]用一種即時檢測的雙光子激發(fā)熒光檢測技術對243株MRSA進行檢測，其中99.0％的MRSA真陽性樣品所需時間小于14小時，該法主要優(yōu)點包括簡單的檢測程序，試劑消耗低，以及高流量能力。近年來有多重新型核酸技術被報道，其中環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術是在2000年由Notomi等發(fā)明的一種體外等溫擴增特異核酸片段的技術[49,50]。自問世以來，數(shù)年間已被廣泛應用于生物安全、疾病診斷、食品分析及環(huán)境監(jiān)測等領域。該方法在簡便、快速、特異性和靈敏度方面具有顯著優(yōu)勢。LAMP反應的靈敏度也極高，其靈敏度可達常規(guī)PCR的10-100倍（檢出限是常規(guī)PCR的1/100～1/10拷貝數(shù)）。因此，對細菌進行檢測時LAMP法在培養(yǎng)時間和所需基因拷貝數(shù)等方面具有較大優(yōu)勢。筆者曾過對118株葡萄球菌進行16SrRNA、femA和mecA三個特異性靶點的LAMP檢測[3]，其中，16SrRNA-LAMP均檢測為陽性，靈敏度與陽性預測值均為100%；而PCR則只檢測其中113株葡萄球菌陽性，靈敏度與陽性預測值分別為95.8%與100%。對65株金葡菌和53株凝固酶陰性葡萄球菌，femA-LAMP的靈敏度、陽性預測值與陰性預測值分別為98.5%、100%與98.1%；而PCR則相應為92.3%、100%與91.4%。對70株甲氧西林耐藥菌和48株敏感菌，mecA-LAMP的靈敏度、陽性預測值與陰性預測值分別為94.3%、100%與92.3%；而PCR則分別為87.1%、100%與84.2%。同時，筆者利用MRSA中的特異靶點orfX，建立一種針對MRSA的快速檢測技術。通過對116株對照菌株進行驗證，顯示該技術的特異性為100%，能有效針對MRSA進行特異檢測。應用該技術檢測667株葡萄球菌，包括566株MRSA、25株MSSA、53株MRCNS與23株MSCNS，結果顯示，靈敏度達98.4%（557/566），而與之平行對比的PCR技術則僅為91.7%（519/566），陽性預測值與陰性預測值分別為100%和92.7%[51]。此外，筆者利用金葡菌中的特異femA基因，建立一種針對金葡菌的LAMP快速檢測體系。通過應用于432株金葡菌（118株臨床與314株食源性菌株）的檢測鑒定，結果顯示，檢出率為98.4%，檢出限為100 fg DNA/Tube與104CFU/ml[52]。

3 結論

綜上所述，抗生素濫用是重要的食品安全問題，其引起的后果不應局限于食物中殘留的微量抗生素，而應擴展至由其引起的細菌耐藥性乃至超級細菌問題。在典型的食源性微生物金葡菌中，耐藥性較為普遍。其中，MRSA 除引起多起食物中毒事件外，同時也是潛在的超級細菌。該類菌株的新型耐藥特點顯示其耐藥性發(fā)展和進化可能由大量歷史較久、在臨床已淡出的抗生素在畜牧業(yè)中的濫用影響并決定；但其具體的分子機制有待進一步深入研究。目前，國內(nèi)外科研工作者已針對 MRSA 菌株的檢測開發(fā)出了許多適用方法，其中LAMP 法由于具有簡便、快速、特異性強和靈敏度高等優(yōu)勢，已獲得越來越多的關注，顯示出較好的實際應用價值。

作者：鄧陽 劉曉晨 李冰 李琳 徐振波 單位：華南理工大學 美國馬里蘭大學生物醫(yī)學科學系