細胞的生物學特性精選(九篇)

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第1篇：細胞的生物學特性范文

0.009）；單克隆p75NTR陽性細胞再培養(yǎng)2周后，p75NTR陽性細胞率分別降為14.5%（Tca-8113）和5.8%（Cal-27）；p75NTR陽性細胞體外增殖能力顯著增強，且具有明顯的侵襲遷移能力。結(jié)論 p75NTR陽性舌鱗狀細胞癌細胞具有腫瘤干細胞的特性。

[關(guān)鍵詞] 舌鱗狀細胞癌； 腫瘤干細胞； p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體

[中圖分類號] R 739.86 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.01.005

Study of the biological characteristics of p75 neurotrophin receptor positive tongue squamous cell carcinoma cells Tong Dongdong1，2， Zhang Fenghe1，2， Yao Yao3， Zhang Zhaotao1，2， Wang Jinbing1，2， Li Qing1，2， Zhang Xinlian1，2. （1. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery， Stomatology Hospital of Shandong University， Jinan 250012， China； 2. Shandong Provincial Key Labo-ratory of Oral Biomedicine， Jinan 250012， China； 3. Dept. of Stomatology， Anhui No.2 Provincial People’s Hospital， Anhui 230022， China）

[Abstract] Objective To study the biological characteristics of p75 neurotrophin receptor positive （p75NTR+） tongue squa-mous cell carcinoma cells which were separated by flow cytometry cell sorting. Methods To determine the biological cha-racteristics of p75NTR+ cells which were separated from Tca-8113 and Cal-27 tongue squamous cell carcinoma cells by flow cytometry cell sorting， including study the capacity of cloning， 3-（4，5）-demethylthiazo（z-y1）-3，5-diphenytetrazoliumromide （MTT） assay， wound healing assay. p75NTR+ cells with non-sorted cells were as control group. Results In Tca-8ll3 and Cal-27 tongue squamous cell carcinoma cell lines， the percentage of p75NTR+ cells were 3.1% and 1.9%. Compared with p75NTR+ cells with non-sorted cells， p75NTR+ cells possess higher capacity of cloning （Tca-8113， P=0.024； Cal-27， P=0.009）. The per-centage of p75NTR+ cells of the progeny cells generated from monoclonal p75NTR+ cells decreased to 14.5% （Tca-8113） and 5.8% （Cal-27） after cultured two weeks. p75NTR+ cells possessed higher proliferation ability and higher metastasis ability than non-sorted cells. Conclusion p75NTR+ cells isolated from tongue squamous cell carcinoma have the characteristics of cancer stem cells.

[Key words] tongue squamous cell carcinoma； cancer stem cells； p75 neurotrophin receptor

腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）是腫瘤組織中具有自我更新、多向分化及較強增殖能力的少量干細胞樣癌細胞亞群，是腫瘤起源、生長、轉(zhuǎn)移與復發(fā)的根源所在。近年來，尋找靶向殺死腫瘤干細胞的抗癌策略已成為研究的熱點。其中，選擇何種細胞表面標志物來證實舌癌中腫瘤干細胞的存在并完成對腫瘤干細胞的提取和鑒別是首要亟待解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體（p75 neu-rotrophin receptor，p75NTR）的表達與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，并已證實其在全身多種腫瘤中可以作為一種腫瘤干細胞的表面標志物[1]。本實驗采用p75NTR對舌鱗狀細胞癌細胞系Tca-8113及Cal-27進行標記、檢測、分選，并對分選后的p75NTR陽性細胞進行生物學特性研究，探討p75NTR作為腫瘤干細胞標志物和預(yù)測口腔鱗狀細胞癌愈后指標的可能性，為深入研究舌鱗狀細胞癌的發(fā)病機理和尋找新的治療靶點提供線索。

1 材料和方法

1.1 材料

Tca-8113、Cal-27細胞株來源于口腔舌鱗狀細胞癌，由上海交通大學附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科腫瘤生物實驗室惠贈。Tca-8113細胞株用含10%FBS（杭州四季青生物工程材料研究所）的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。Cal-27細胞株用含10%FBS（GIBCO公司，美國）的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。PE標記的鼠抗人p75NTR抗體及PE標記的小鼠骨髓瘤蛋白IgG1，κ抗體均購自美國BD公司。

1.2 流式細胞儀檢測p75NTR陽性細胞的表達

將生長狀況良好并處于對數(shù)生長期的Tca-8113細胞制備成單細胞懸液，并且調(diào)整細胞密度為1.0×106個·mL-1 。實驗分為2組，實驗組加入100 μL PE標記小鼠抗人p75NTR抗體，對照組加入等量的PE標記小鼠骨髓瘤蛋白IgG1，κ。放入冰里置于震蕩箱中蔽光孵育半小時，1 000 r·min-1離心5 min，吸棄上清后Buffer I l mL沖洗吹打（反復沖洗、離心2次），重懸于400 μL PBS中。將加入等量PE標記小鼠骨髓瘤蛋白IgG1，κ的對照組先上機調(diào)節(jié)機器參數(shù)，然后取實驗組上機檢測細胞熒光值，分析p75NTR陽性細胞的百分含量，重復3次取平均值。同法處理Cal-27細胞。

1.3 p75NTR陽性細胞生物學特性檢測

1.3.1 以p75NTR為標記分選陽性細胞作為實驗組 將生長狀況良好并處于對數(shù)生長期的較大數(shù)量的2種舌鱗狀細胞癌細胞（約1.0×108個·mL-1）如上法處理后上機進行高速分選，獲得p75NTR陽性細胞，作為實驗組。為了保證分選后富集的p75NTR陽性細胞的純度，分選時選取強陽性區(qū)域。重復上機一次，以避免標記物丟失造成的陽性率偏低。并取適量分選后的細胞上機檢測p75NTR陽性細胞的純度。

1.3.2 對照組處理 將同等條件培養(yǎng)的2種舌鱗狀細胞癌細胞系細胞制備成單細胞懸液，加入PE標記小鼠抗人p75NTR抗體，放入冰里置于震蕩箱中蔽光孵育半小時，再放入離心機離心5 min（1 000 r·min-1），棄上清后Buffer I l mL沖洗吹打（反復沖洗、離心2次），作為對照組備用。

1.3.3 單克隆培養(yǎng) 取對數(shù)生長期的2組細胞于超凈臺中常規(guī)消化制成單細胞懸液后，用有限稀釋法接種于96孔板中。5%CO2、37 ℃飽和溫度環(huán)境培養(yǎng)觀察細胞貼壁情況，記錄僅有一個細胞的孔，并做標記。2周后統(tǒng)計單克隆形成率。收集p75NTR陽性細胞形成的單克隆細胞，培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，再培養(yǎng)2周后進行p75NTR的流式細胞檢測。

1.3.4 四甲基偶氮唑鹽比色法[（3-（4，5）-demethylthiazo

（z-y1）-3，5-diphenytetrazoliumromide，MTT]實驗 收集2組細胞，分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板中（每孔約4×103個細胞）（周邊空不加），再各加入200 μL培養(yǎng)液（周邊空不加，B3孔只加入PBS作為對照）。培養(yǎng)24 h后，換液，B3孔換200 μL PBS。每孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h后吸出上清液，加入150 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），置于搖床上低速震蕩10 min。以B3孔為調(diào)零孔，上酶聯(lián)免疫檢測儀，以490 nm吸光度值量化活細胞數(shù)，每次檢測一豎列的6個平行孔，每組所得數(shù)據(jù)取平均值，連續(xù)檢測7 d。以生長時間為橫坐標，以光密度（op-tical density，OD）值為縱坐標，繪制細胞的生長曲線。

1.3.5 劃痕實驗 將2組細胞以每孔1×105個的密度接種于六孔板中，待細胞生長到80%～90%時，無菌條件下更換為無血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，于超凈臺中用200 μL槍頭在每個孔的中間劃一條豎直的線，PBS沖洗3遍。每孔加入2 mL完全培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。之后每天換液，拍照，連續(xù)8 d。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。各組間的比較采用χ2檢驗進行分析，P

2 結(jié)果

2.1 流式細胞儀檢測p75NTR陽性細胞的表達

舌鱗狀細胞癌細胞株Tca-8113、Cal-27細胞中，p75NTR陽性細胞的比例分別為3.1%和1.9%。

2.2 流式細胞分選及純度檢測

分選后p75NTR陽性細胞的比例分別為98.1%（Tca-

8113）和97.4%（Cal-27）。這表明目的細胞陽性率比較高。

2.3 單克隆培養(yǎng)

2組單克隆形成能力的比較見表1。從表1可見，只有小部分細胞能持續(xù)分裂增殖。實驗組的單克隆形成能力高于對照組（Tca-8113細胞，P=0.024；Cal-

27細胞，P=0.009）。這表明p75NTR陽性細胞具有自我更新和分化能力。單克隆細胞再培養(yǎng)2周后，Tca-

8113的p75NTR陽性細胞率降為14.5%，Cal-27的p75NTR陽性細胞率降為5.8%。

2.4 MTT實驗

細胞生長曲線（圖1、2）表明：2組細胞第1天生長情況無明顯差異，從第3天之后實驗組細胞較之對照組細胞體外增殖能力明顯增強，第5天及第7天時更加顯著（P

2.5 劃痕實驗

劃痕后7 d，實驗組較對照組具有明顯的愈合能力（圖3、4）。Tca-8113實驗組到第8天已經(jīng)基本被細胞長滿，而對照組卻仍有空白區(qū)域（圖5），Cal-

27實驗組到第5天已經(jīng)基本長滿劃痕區(qū)域，完全長滿需要7 d（圖6）。這說明實驗組具有明顯的侵襲遷移能力。

圖 1 2組Tca-8113細胞生長曲線（MTT實驗）

Fig 1 Cells growth curve of Tca-8113 of two groups （MTT test）

圖 2 2組Cal-27細胞生長曲線（MTT實驗）

Fig 2 Cells growth curve of Cal-27 of two groups （MTT test）

圖 5 2組Tca-8113細胞不同時間的劃痕距離比較

Fig 5 The comparison of scratch distance in different times of Tca-

8113 of two groups

圖 6 2組Cal-27細胞不同時間的劃痕距離比較

Fig 6 The comparison of scratch distance in different times of Cal-

27 of two groups

3 討論

腫瘤干細胞是腫瘤起源、生長、轉(zhuǎn)移與復發(fā)的根源所在。近年來，通過對其生物學特性的研究，尋找靶向殺死腫瘤干細胞的抗癌策略成為研究的熱點。p75NTR是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子的低親和力受體，可通過不同的信號傳導通路誘導細胞發(fā)生增殖、分化、遷移、凋亡等生物學行為。近年來，研究發(fā)現(xiàn)p75NTR的表達與胃癌[2] 、視網(wǎng)膜成神經(jīng)細胞瘤[3]、前列腺癌[4]、胰腺癌[5]、黑色素瘤[6]等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，并已證實其在全身多種腫瘤中可作為一種腫瘤干細胞的表面標志物[1]。本實驗檢測發(fā)現(xiàn)p75NTR在舌鱗狀細胞癌細胞系Tca-8113及Cal-27中都有陽性表達，且其陽性率分別為3.1%和1.9%。這與以往報道中腫瘤干細胞數(shù)量相當[7-8] 。

腫瘤細胞的克隆形成能力與其致瘤能力呈正相關(guān)[9]，并且只有腫瘤干細胞具有單克隆形成能力和強致瘤性[10-11]。本研究單克隆培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)兩個細胞株的p75NTR陽性細胞的體外單克隆形成能力相對于未分選的細胞均顯著增強，符合其是具有自我更新能力的腫瘤干細胞的理論。同時，本實驗利用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)單克隆4周后的p75NTR陽性細胞的p75NTR陽性率明顯下降，其分化產(chǎn)生了大量p75NTR陰性細胞，該結(jié)果說明p75NTR陽性細胞具有較強的克隆形成能力并具有一定的分化潛能。

本研究用MTT法對舌鱗狀細胞癌細胞株Tca-8113和Cal-27中的p75NTR陽性細胞及未分選細胞的體外增殖能力進行測定，發(fā)現(xiàn)p75NTR陽性細胞的生長速度明顯快于未分選的細胞，這也表明p75NTR陽性細胞具有較強的增殖能力，符合其作為腫瘤干細胞的特性。侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學行為，是導致手術(shù)、放療、化療失敗和患者死亡的主要原因。劃痕實驗證明p75NTR陽性細胞具有更強的遷移能力。由于2種細胞的生長速度差別較大，所以在劃痕實驗中沒有做同期的橫向比較。

綜上，筆者認為p75NTR可作為舌鱗狀細胞癌干細胞的一種表面標志物。由于本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)p75NTR在正常舌組織中是陰性表達的[12]，那么針對p75NTR這個新的靶點對腫瘤進行的治療就不會對正常舌干細胞構(gòu)成傷害。當然，針對臨床應(yīng)用還需要更深入的研究，但是相信隨著研究的不斷進展，其將有望為舌癌的臨床預(yù)防和診治開辟新的思路和策略。

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第2篇：細胞的生物學特性范文

【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細胞；細胞培養(yǎng)；細胞鑒定

【中圖分類號】R392.4【文獻標識碼】A【文章編號】1044-5511（2011）11-0346-02

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-drived mes-enchymal stem cells,BMSCs是來源于骨髓的 MSCs，具有采集方便的優(yōu)點，是理想的組織工程種子細胞［1］具有多向分化和自我復制潛能,易于自體采集、無免疫排斥反應(yīng)、避免倫理學限制等優(yōu)點,在細胞治療方面得到了廣泛的應(yīng)用。但是BMSCs在骨髓微環(huán)境中所占比例極少,使用何種簡單操作方法快速獲取形態(tài)均一和純度較高的BMSCs便成為該研究領(lǐng)域關(guān)注的焦點［2］。本實驗采用全骨髓貼壁細胞培養(yǎng)法和密度梯度離心法相結(jié)合分離、純化BMSCs，通過體外培養(yǎng)擴增，以及流式細胞術(shù)鑒定，建立穩(wěn)定的BMSCs培養(yǎng)擴增方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：日本大耳白兔4只，4周齡，雌雄不限，體重250~300g，購于蘭州生物制品研究所。

1.2 主要試劑及儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱(BB16UV型,德國Heraeus公司)、超凈工作臺(VS-1300L型,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限責任公司)、倒置相差顯微鏡、超聲波清洗儀、純凈水系統(tǒng)、酸度計、臺式高速離心機(北京科偉永鑫實驗儀器設(shè)備廠)、低糖培養(yǎng)基(GBICO公司)、胎牛血清（杭州四季青）、谷氨酰胺、青鏈霉素、胰酶、流式細胞抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.3 兔BMSCs的采集： 取4周齡日本大耳白兔一只，雌雄不限，20ml空針空氣栓子經(jīng)耳緣靜脈注入，待兔死亡后，將其全部浸泡于75%酒精溶液內(nèi)8~10分鐘，在無菌環(huán)境下切開前后肢皮膚，切下兔前后兩肢，剃去覆蓋于肱骨、脛骨及股骨上的肌肉組織，注意保留骨的完整性，用組織剪分離股骨、脛骨及肱骨，將其置于無菌培養(yǎng)皿中，縱向依次剪開各長骨兩端，5ml注射器沿剪開的骨端注入L-DMEM沖洗3次，收集沖洗液約10ml，用篩網(wǎng)過濾沖洗液，加入完全低糖培養(yǎng)基重懸組織沖洗液，吸管反復吹打混勻，1000 r/ min ，4 ℃，離心 5 min ，棄去上清。再次加入適量完全低糖培養(yǎng)基，吹打混勻，分別加入一次性培養(yǎng)皿中，放入37℃，體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（圖1）。

1.4 兔 BMSCs 培養(yǎng)：1.4.1 原代 BMSCs 培養(yǎng) 向分離得到的細胞組織懸液加入 10ml 含 20 %胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的 L-DMEM 培養(yǎng)基重懸細胞，并轉(zhuǎn)移至中號塑料培養(yǎng)皿內(nèi)。將培養(yǎng)皿置于37 ℃，體積分數(shù)為 5 %的 CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng) 72 h后使用含 20 %FBS 的 L-DMEM 完全培養(yǎng)基換液。原代培養(yǎng) 5-7 天后，細胞融合可達 80 %以上。將原代培養(yǎng)的 BMSCs 在倒置相差顯微鏡下觀察細胞集落的形成和細胞形態(tài)（圖2）。

1.4.2 傳代 BMSCs 培養(yǎng) 待原代細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底后，用EDTA胰蛋白酶消化貼壁細胞，F(xiàn)BS 終止消化后將細胞懸液以 1:3 比例接種于新培養(yǎng)瓶中，加入含 10 %FBS 的 L-DMEM完全培養(yǎng)基 5ml 培養(yǎng)，每隔 2 天換液，約 3-4 天后細胞可鋪滿瓶底。將傳代培養(yǎng)的 BMSCs 在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。以此方法，向后傳至三代（圖3、4）。

1.5 兔 BMSCs的鑒定

對干細胞的鑒定主要是建立在對細胞表面標記物的識別基礎(chǔ)上，采用流式細胞儀特有的細胞分析技術(shù)，可在短時間內(nèi)精確分析出細胞表型以及其所占有的比例，使用間接標記法標記 CD44、CD34。取第3 代 BMSCs 以 2.0×105/mL 重懸，PBS 洗滌細胞 3次，向細胞懸液中加入鼠抗兔CD44、CD34 （稀釋 1:100） 為一抗，4 ℃保存 30 min，加入羊抗鼠含 FITC、PE 的二抗，4 ℃避光保存 30min。PBS 洗滌細胞 3 次后放入流式細胞儀中檢測。記錄數(shù)據(jù)（圖5、6）。

2 討論

BMSCs具有貼壁性、具有強大的增殖能力和多向分化潛能、具有免疫調(diào)節(jié)功能、具有來源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴增和純化，多次傳代擴增后仍具有干細胞特性，不存在免疫排斥的特性。

2.1更好地增加BMSCs的貼壁性： 在BMSCs培養(yǎng)中，細胞貼壁培養(yǎng)與傳代成功與否是本實驗的關(guān)鍵。其中存在很多問題，比如在細胞貼壁方面，用一次性塑料培養(yǎng)皿效果要優(yōu)于可重復使用的玻璃培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿。塑料培養(yǎng)皿內(nèi)壁有一層鼠尾膠原，它可以更好地促使骨髓間充質(zhì)干細胞貼壁。

2.2 培養(yǎng)基最佳的酸堿度： 培養(yǎng)基中加碳酸氫鈉的目的，是為了在二氧化碳培養(yǎng)箱中平衡培養(yǎng)基中的PH值。對于GBICO的DMEM培養(yǎng)基，3.7g是對應(yīng)二氧化碳培養(yǎng)箱的二氧化碳濃度設(shè)定在10%，而5%的則對應(yīng)的是2g碳酸氫鈉。暴露在空氣中的培養(yǎng)液，因為大氣中二氧化碳的濃度很低，液體中的二氧化碳會氣體分壓高于大氣，因此會逐漸溢出，濃度逐漸降低，液體的PH值也逐漸升高，如果DMEM在空氣中存放時間過長，它將有可能變成紫紅色。一般新配置的顏色正常，在多次開蓋，培養(yǎng)液接觸空氣的時間較長后，顏色會逐漸變成紫紅色，筆者的做法是，配制培養(yǎng)液時加hepes，用小容量的分裝瓶分裝，及盡量減少培養(yǎng)液與空氣的接觸時間。配培養(yǎng)基時，將酸堿度調(diào)至6.9-7.0，過濾后酸堿度會適當增高。

2.3 傳代的注意事項

2.3.1 EDTA-胰酶最佳消化時間：具筆者在試驗中的觀察，在BMSCs傳代過程中，根據(jù)培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中貼壁細胞的覆蓋率確定，當BMSCs貼壁達到80%-90%就可以傳代了，用玻璃尖吸管滴入EDTA-胰酶4-7滴，在倒置相差顯微鏡下觀察，當細胞70%由原來的紡錘狀、梭形變化為橢圓形時為最佳時間，一般為1至2分鐘。

2.3.2 加入EDTA-胰酶后的吹打時間與次數(shù) ：加入EDTA-胰酶后，靜置1分鐘，在鏡下觀察細胞變橢圓或圓形，并有輕度漂浮時，用尖吸管輕輕吹打3-6次即可。

2.3.3 骨髓間充質(zhì)干細胞特異性標志物： 雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞特異性標志物，Pittenger等認為CD29、CD44、CD105、CD166、SH2、SH3為間充質(zhì)干細胞的重要標志物［3］。

綜上所述，對 BMSCs 的形態(tài)學觀察和表型分子鑒定實驗均證實培養(yǎng)傳代的 BMSCs 的生物學特性并未發(fā)生明顯改變，說明本實驗的分離培養(yǎng)擴增方法安全有效。本實驗成功的建立了一系列分離、體外培養(yǎng)和擴增兔 BMSCs 的實驗方法，為進一步組織工程研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

參考文獻

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［2］骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及生物學特性 陳建梅姚榮偉 李勇 張馥敏 江蘇醫(yī)藥2010年10月第36卷第19期2306-2308

第3篇：細胞的生物學特性范文

關(guān)鍵詞：5-aza-dc；延邊奶山羊；細胞活率；細胞形態(tài)；細胞凋亡

中圖分類號：S827 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）12-2862-04

Effect of 5-aza-dc on the Biological Characteristics of Yanbian Dairy Goat Ear Fibroblast Cell

CAI Li-juan，YIN Duo，ZHUANG Li-li，F(xiàn)NAG Nan-zhu，LI Zhong-shu

（Animal Genetic and Breeding Reproduction Laboratory， Agricultural College， Yanbian University， Yanji 133002，Jilin，China）

Abstract： To research the effects of DNA methylation inhibitor 5-aza-dc on biological characteristics of Yanbian dairy goat ear fibroblast cell， MTT method was used to determine the optimal action concentration and time of 5-aza-dc on Yanbian dairy goat ear fibroblast cells. PI and Hochest33342 double staining， agarose gel electrophoresis were used to detect apoptosis of the cells； and karyotype analysis to measure the effect of 5-aza-dc on the chromosomes. The results showed low concentration（≤0.010 μmol/L） of 5-aza-dC treatment for 72 h had little effect on the cells. With the increasing of concentration， cell morphology， viability， apoptosis and chromosomes were all significantly affected. The best processing time of 5-aza-dc was 72 h， low concentration of 5-aza-dc did not lead to apoptosis and karyotype change.

Key words： 5-aza-dc； Yanbian dairy goat； cell morphology； cell viability； cell apoptosis

體細胞核移植是哺乳動物胚胎工程的主要組成部分，也一直是研究的熱點。然而核移植研究中仍然存在著許多問題，如核移植效率低、胚胎發(fā)育異常、流產(chǎn)、畸形等。大量研究表明，體細胞核移植所用的供體細胞（成纖維細胞、顆粒細胞等）都是高度分化的細胞，具有較高的甲基化水平，在與受體細胞融合時需要經(jīng)過去甲基化才能維持胚胎正常發(fā)育，如果重構(gòu)胚基因組DNA的甲基化模式存在異常，可引起特定基因轉(zhuǎn)錄模式發(fā)生改變，從而導致重構(gòu)胚發(fā)育異常。因此，有必要尋找一種降低DNA甲基化水平，進而改善核移植效率的方法。5-氮-2′-脫氧胞嘧啶核苷（5-aza-dc）是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，為正常胞嘧啶核苷的類似物。在細胞內(nèi)這種核苷類似物可以轉(zhuǎn)化為脫氧核苷三磷酸，并在DNA復制的過程中替代正常的胞嘧啶核苷酸參與到延伸的DNA鏈中，一旦進入DNA雙鏈后，它們所含有的修飾堿基——5-氮胞嘧啶可以與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價結(jié)合，使酶的活性降低，最終使處理細胞基因組DNA發(fā)生去甲基化；有研究表明DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dc處理牛供體細胞，能有效降低其甲基化水平[1，2]。舒金輝[3]利用5-aza-dc（0.005～0.09 μmol/L）處理水牛成纖維細胞，顯著降低了供體細胞的甲基化水平并提高了隨后核移植的效率。延邊奶山羊耳成纖維細胞作為延邊奶山羊體細胞克隆的核供體有重要的研究意義。因此，本研究旨在探討5-aza-dc對延邊奶山羊體細胞克隆供體細胞的影響，為提高延邊奶山羊體細胞克隆效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 試劑 DMEM、EDTA、DMSO、5-aza-dc（DMSO預(yù)融，超純水配制成0.25 mg/mL的濃縮液備用）、PI、Hochest33342、MTT、Giemsa染液、胰蛋白酶及其他基礎(chǔ)藥類均購自SIGMA中國有限公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，DNA提取試劑盒購自寶生物（大連）有限公司。

1.1.2 材料 延邊奶山羊耳部組織塊。剪取奶山羊（母）耳部血管較少處組織，大約1.5×2.0 cm2。用PBS沖洗1次，75%酒精浸泡30 s，再用PBS沖洗3次，最后將組織塊剪碎。經(jīng)過3～5次PBS及胰蛋白酶洗滌后，均勻接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，5 h后加含15% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液[4]。每3～5 d換液1次。當原代細胞匯合至80%時，消化傳代，3代以后的成纖維細胞可用于試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 5-aza-dc處理延邊奶山羊耳成纖維細胞 取3代以上的延邊奶山羊耳成纖維細胞，消化傳代，調(diào)整細胞密度為105個/mL，接種于24孔或96孔培養(yǎng)板，待細胞處于對數(shù)生長期，改用添加5-aza-dc的10%DMEM培養(yǎng)液分別培養(yǎng)。5-aza-dc的濃度設(shè)定為0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L。

1.2.2 5-aza-dc對細胞活率的影響 不同濃度（0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L）的5-aza-dc各處理成纖維細胞24、48、72、96 h后，96孔板每孔添加5 mg/mL MTT 10 μL，作用4 h 后，吸出培養(yǎng)液，每孔添加150 μL DMSO，振蕩10 min，酶聯(lián)反應(yīng)儀測492 nm處的OD值。

1.2.3 5-aza-dc對細胞形態(tài)的影響 不同濃度（0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L）的5-aza-dc處理成纖維細胞72 h后，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.4 5-aza-dc對細胞染色體的影響 不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細胞72 h后，換液，每孔添加50 μL秋水仙素，2.5～3.0 h后，消化懸浮細胞，1 000 r/min 離心10 min，37 ℃預(yù)溫的0.075 mol/L KCl低滲處理30 min后，用新鮮固定液（甲醛∶冰醋酸=18∶7，V/V）固定細胞2次，最后用0.5～1.0 mL固定液懸浮細胞，滴片，Giemsa染色，干燥后于油鏡觀察[5]。每組處理選取一定數(shù)量的清晰分裂相，記錄變異的染色體數(shù)目。

1.2.5 5-aza-dc對細胞凋亡的影響

1）Hochest33342/PI雙染法熒光顯色法檢測細胞凋亡。不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細胞72 h后，消化懸浮細胞，調(diào)整細胞密度為106個/mL，加入5 μg/mL的Hochest33342熒光染色，37 ℃避光孵育10 min，離心去上清，用培養(yǎng)液懸浮，加入5 μg/mL的PI染色液，4 ℃冰箱孵育15 min，熒光顯微鏡下觀察[6]。

2）瓊脂糖凝膠電泳法檢測細胞凋亡。不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細胞72 h后，消化收集細胞于1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心5 min，500 μL PBS懸浮細胞后，按DNA提取試劑盒步驟提取DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗所得數(shù)據(jù)使用SPSS17.0進行分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）的方法處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 5-aza-dc對細胞活率的影響

由表1可知，不同濃度的5-aza-dc分別培養(yǎng)延邊奶山羊耳成纖維細胞24、48、72、96 h后的細胞活率，比較可知72 h組效果較好，且與48 h、96 h組差異不顯著，因此后續(xù)試驗中細胞均處理72 h。

2.2 5-aza-dc對細胞形態(tài)的影響

由圖1可知，未經(jīng)5-aza-dc處理的細胞生長狀態(tài)良好，接觸緊密，細胞大小均一，生長速度較快。而經(jīng)過5-aza-dc處理后的細胞隨著5-aza-dc濃度的升高，細胞變得細長，生長緩慢，細胞間隙增大，形態(tài)不規(guī)則，甚至有的地方細胞大片脫壁死亡。

2.3 5-aza-dc對細胞染色體的影響

采用常規(guī)核型分析方法，分析不同濃度的5-aza-dc處理的延邊奶山羊耳成纖維細胞，每個處理組選取50個分散較好的清晰分裂相，統(tǒng)計畸變?nèi)旧w概率。由圖2可知，當濃度≤0.010 μmol/L時，染色體畸變率對照組與其他兩組差異不顯著；當濃度≥0.030 μmol/L時染色體畸變率顯著增加，出現(xiàn)多倍體（圖3）。當濃度達到0.1 μmol/L時，染色體畸變率達到12%。

2.4 5-aza-dc對細胞凋亡的影響

2.4.1 Hochest33342/PI雙染法熒光顯色法檢測細胞凋亡 Hochest33342/PI雙染色后，在熒光顯微鏡下可見凋亡細胞呈強藍色、弱紅色熒光，壞死細胞呈強紅色，而正常的細胞則呈弱藍色熒光。當濃度為0、0.005、0.010 μmol/L時，凋亡細胞較少；濃度≥0.030 μmol/L時出現(xiàn)較多凋亡細胞；濃度為0.100 μmol/L時，細胞凋亡增加，死細胞數(shù)目也增多。如圖4所示。

2.4.2 瓊脂糖凝膠電泳法檢測細胞凋亡 由圖5可知，當濃度≤0.010 μmol/L時，細胞無拖帶現(xiàn)象，說明無凋亡細胞；濃度≥0.030 μmol/L時開始出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象，說明出現(xiàn)凋亡細胞；濃度為0.050、0.100 μmol/L時，細胞大量凋亡，拖帶現(xiàn)象明顯。

3 討論

3.1 5-aza-dc對細胞活率、細胞形態(tài)的影響

5-aza-dc是一種典型的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，為胞嘧啶核苷的類似物。Kumar等[7]利用0、0.5、1.0、2.0、3.0 μmol/L的5-aza-dc處理第五代豬胎兒成纖維細胞（PFF），發(fā)現(xiàn)不同濃度的5-aza-dc均抑制PFF的生長，較高濃度的5-aza-dc處理會導致細胞的形態(tài)和染色體的倍性發(fā)生改變。Enright等[8]對供體成纖維細胞進行5-aza-dc處理后發(fā)現(xiàn)高劑量5-aza-dc（0.08～0.31 μmol/L）可以降低細胞甲基化水平，其研究也發(fā)現(xiàn)5-aza-dc處理72 h為最佳處理時間。鑒于5-aza-dc對細胞的毒性作用，本試驗采用較低濃度的5-aza-dc（0～0.100 μmol/L）處理延邊奶山羊耳成纖維細胞。結(jié)果表明，經(jīng)5-aza-dc處理后的細胞生長速度、形態(tài)等與對照組相比無明顯差異，說明延邊奶山羊耳成纖維細胞對5-aza-dc具有較強的耐受性。但是隨著處理時間的延長，細胞形態(tài)改變、死亡數(shù)增多，逐漸出現(xiàn)脫壁等現(xiàn)象，這可能是與5-aza-dc對細胞的毒性有關(guān)。這與Kumar等[7]的試驗結(jié)果一致。

3.2 5-aza-dc對細胞染色體的影響

有研究證明，供體細胞的培養(yǎng)環(huán)境以及藥物等處理會導致其染色體異常，進而引起隨后NT胚胎染色體異常，說明在核移植前首先檢查供體細胞的染色體還是必要的[9]。本試驗使用常規(guī)染色體核型分析方法，即經(jīng)低滲、固定、Giemsa染色等步驟后，滴片制備染色體標本。結(jié)果表明，高濃度的5-aza-dc對細胞染色體有致畸作用，濃度越高染色體出現(xiàn)異常的幾率越大；而低濃度（≤0.010 μmol/L）對染色體影響不大。通過瓊脂糖凝膠電泳實驗進一步驗證高濃度的5-aza-dc對染色體的影響，可見明顯的拖帶現(xiàn)象，分析原因可能是染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如斷裂等。

3.3 5-aza-dc對細胞凋亡的影響

PI、Hochest33342均可與細胞核DNA（或RNA）結(jié)合。但是PI不能通過正常的細胞膜，Hochest33342則為膜通透性的熒光染料，故細胞在處于壞死或晚期凋亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。本研究用5-aza-dc處理延邊奶山羊耳成纖維細胞72 h后，觀察不同的濃度對細胞凋亡的影響，采用Hochest33342和PI雙染色法檢測細胞凋亡，在熒光顯微鏡下可見凋亡細胞呈強藍色、弱紅色熒光，壞死細胞呈強紅色，而正常的細胞則呈弱藍色熒光。正常細胞和中早期凋亡細胞均可被Hochest33342著色，但是正常細胞核的Hochest33342著色的形態(tài)呈圓形，淡藍色，內(nèi)有較深的藍色顆粒；而凋亡細胞的核由于濃集而呈亮藍色，或核呈分葉，碎片狀。細胞凋亡最明顯的生化特征是Ca2+、Mg2+依賴的內(nèi)源性核酸酶的激活，細胞核染色體從核小體間斷裂成180～200 bp的寡核苷酸片段。針對這些片段應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。凋亡細胞呈明顯的梯狀條帶。本研究通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見，0～0.010 μmol/L幾組都沒有出現(xiàn)明顯的拖帶現(xiàn)象，而從0.030 μmol/L組就開始有拖帶現(xiàn)象，0.050 μmol/L 和0.100 μmol/L濃度組與對照組相比細胞發(fā)生凋亡的比例顯著增加。此結(jié)果進一步證明高濃度的5-aza-dc可以導致細胞凋亡。

5-aza-dc處理延邊奶山羊成纖維細胞適宜時間為72 h，隨著5-aza-dc處理濃度的升高，細胞形態(tài)有所改變，接觸不緊密。當濃度升高到0.100 μmol/L時大片細胞脫壁死亡；當濃度≥0.030 μmol/L時，染色體畸變率顯著增加，0.005 μmol/L和0.010 μmol/L組對染色體核型的影響與對照組相比差異不顯著；瓊脂糖凝膠電泳法檢測經(jīng)5-aza-dc處理的細胞凋亡情況，結(jié)果表明高濃度的5-aza-dc可以導致細胞凋亡，低濃度的5-aza-dc對細胞凋亡的影響較小。以上說明高濃度的5-aza-dc對細胞有一定毒性作用，但是低濃度對細胞影響較小，可以應(yīng)用低濃度的5-aza-dc作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理供體成纖維細胞，嘗試建立一種既不影響成纖維細胞生物學特性，又可以降低供體細胞核的甲基化狀態(tài)的方法，從而提供一種提高體細胞核移植效率的方法。

參考文獻：

[1] 李世杰.體細胞克隆中核的重編程[J].科學通報，2004，49（8）：721-726.

[2] 馬康目.細胞核重編程對克隆的影響[J].生命科學，2008，20（3）：431-437.

[3] 舒金輝.水牛體細胞核移植與甲基化檢測的研究 [D].南寧：廣西大學，2007.

[4] 于昊贏.不同冷凍程序和冷凍保護劑對延邊奶山羊耳部成纖維細胞冷凍效果的影響 [D].吉林延吉：延邊大學，2012.

[5] 孫曉冬.延邊奶山羊耳成纖維細胞培養(yǎng)體系的建立 [D]. 吉林延吉：延邊大學，2012.

[6] 李鳳珍. 5-氮-2′-脫氧胞苷對牛成纖維細胞周期、染色體和凋亡的影響 [D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2009.

[7] KUMAR B M，JIN H F，KIM H J，et al.DNA methylation leves in porcine fetal fibroblasts indueed by an inhibitor of methylation 5-aza-dc[J].Cell Tissue Res，2006，325（3）：445-454.

第4篇：細胞的生物學特性范文

【關(guān)鍵詞】中醫(yī)；生物學；生物技術(shù)；研究

【中圖分類號】Q81 【文獻標識碼】A 【文章編號】1008-6455（2010）11-0248-02

Study of TCM bioengineeing

Ouyang Xuejian

【Abstract】From angle of TCM bioengineering probe into TCM basic theory and way of study, to basis of TCM and clinical research mean much.

【Key words】traditional chinese medicine (TCM); biology; biotechnology; study

隨著TCM的不斷創(chuàng)新，用現(xiàn)代中醫(yī)生物學的研究手段，完善TCM的基礎(chǔ)理論是必經(jīng)之路。

1生命之書

1960年首次被破譯遺傳密碼，分子生物學家對復雜的細胞分子進行了分類。人類基因從遠古到現(xiàn)代以密碼的形式表達出來，展現(xiàn)在科學家面前。常有一種誤解基因代表每個特性，這種誤解并沒有因基因測序而被消除，并被加強了這是因為單基因病被討論[1]，事實上許多遺傳性疾病是由多個基因以某種未知方式相互作用的結(jié)果。人類基因組的解譯，象征著思想變革的始點走向未來。

2生物學革命

細胞生物學革命并不是基因組的解譯，而是基因行為方式和序列間相互作用的發(fā)現(xiàn)，但必須通過實驗才能得到體現(xiàn), 即閱讀細胞故事要歸功于生物學-DNA芯片[2]。它能同時觀測許多基因行為的是基因組測序。即一個細胞隨時有數(shù)千個基因開啟，它不僅開啟一個或兩個基因來完成任務(wù)，并在任務(wù)完成后再將它們關(guān)閉，但其理論的構(gòu)建并不是輕易獲得的。分子和細胞生物學[8]，簡潔一流的理論很少見，蛋白質(zhì)A開啟了蛋白質(zhì)B，然后激活蛋白質(zhì)C，如果大家能理解將對研究很有幫助。生物學家并引入了物理學概念，尋找簡潔一流理論，但是并不表明研究的系統(tǒng)是簡潔的。物理學家設(shè)計的理論用于解釋大量分子行為，如氧的彌散在介質(zhì)的作用下，個體特性會淹沒在團體行為的模式下?；蚝偷鞍踪|(zhì)更具挑戰(zhàn)性，因為它們不移動，不隨機相互作用，但能選擇性的參與某一功能性活動?；瘜W提供了另一組工具，一些非生命系統(tǒng)中的化學過程與生物化學過程一樣復雜混亂，但并不妨礙被計算機模型所獲取，其結(jié)論是使復雜的模型簡單化，原因是一些成分可以被忽略。

3計算機模擬藝術(shù)

它不僅分析數(shù)據(jù)也是一種重要工具。物理學家把其藝術(shù)帶入到了精密狀態(tài)，天體物理學家能模擬整個星系世界，生物學家就能模擬細胞的微觀世界。計算機模擬復雜的真實細胞，預(yù)測基因活性與細胞功能變化的基因組，并建立了數(shù)據(jù)庫。研究細胞中多種過程的比較模型，許多蛋白質(zhì)能同時催化大范圍化學反應(yīng)，不同反應(yīng)的相對重要性會因基因被激活而產(chǎn)生某種蛋白而再次關(guān)閉，來模擬整個細胞行為。工程學認為一個細胞事件不會簡單的導致某一事件發(fā)生，有時一個過程會影響某個過程發(fā)生，用工程學術(shù)語描述就是反饋。即角加速時人體向一側(cè)傾倒，此時膜半規(guī)管內(nèi)淋巴液向相反方向流動刺壺腹嵴產(chǎn)生神經(jīng)沖動，傳至平衡中樞維持人體平衡，這就是人置與平衡中樞間的反饋，這種自我調(diào)節(jié)在工程學中十分常見。即可用“控制論”和“系統(tǒng)論”來描述它，生物學家已應(yīng)用在細胞中。描述生物學功能包含擴大、改編、加強、絕緣、糾錯和一致性檢測等概念。描述新的生物學語言將來源于綜合科學，即計算機科學或生物工程學等學科[3、4]。

4網(wǎng)絡(luò)生物學

世界范圍互聯(lián)網(wǎng)中的信息總是最新的，那里有通信、高速公路、鐵路、航運等，為網(wǎng)路提供能量、電流、水、物質(zhì)、友誼等，細胞網(wǎng)絡(luò)它們是如此相似。細胞中每一類分子都視為網(wǎng)絡(luò)的組成部分，任何兩個分子之間均有聯(lián)系，共同參與生物化學反應(yīng)，結(jié)論就是細胞網(wǎng)絡(luò)與許多社會網(wǎng)絡(luò)一樣，有著相同的連通結(jié)構(gòu)。這樣的共性對于定義基因間的相互作用很有幫助，但并不是所有網(wǎng)絡(luò)都相同[5、6]，有時幾個連接破壞而迅速瓦解，有時即便有許多連接被破壞，任何兩個節(jié)點間仍可保持通暢，細胞網(wǎng)絡(luò)也是如此。理解了生物學網(wǎng)絡(luò)的特點，為組建細胞自身系統(tǒng)對其研究奠定了基礎(chǔ)。

5生物學模塊

基因通常結(jié)隊工作當細胞分解糖產(chǎn)生能量，激活一組基因來產(chǎn)生各自所需要的酶[7]。理論生物學家提示如果能夠找出這類“聯(lián)合作業(yè)”，并將其視為獨立分子來理解細胞的復雜活動。即一部分制造蛋白質(zhì)，一部分復制細胞分裂的DNA，其他部分對特殊的酶做出響應(yīng)等等。但這些分子不是基因簡單的組合,它們包括了蛋白質(zhì)，RNA小信號分子和富含能量的分子，即酶等共同執(zhí)行其功能, 蛋白質(zhì)組學顯示了它的特殊貢獻。即細胞分裂模塊包裹在膜內(nèi)，如線粒體是能量的“工廠”。就像組建大樓一樣，模塊之間通過一類或幾類介質(zhì)分子相互聯(lián)系，各部門備有“辦公室備忘錄”這就解決了每個突發(fā)件事的需要?？上胂笤O(shè)計一種更精密的特定模塊，其小部分分子間相互作用的模塊延伸到整個細胞。模塊的功能來自其他模塊一部分輸入，并產(chǎn)生輸出影響其他模塊。其集體行為的概念類似于生物物理學概念，能表現(xiàn)模塊的特性。即模塊大部分功能特征，來自于潛在成分的特征與它們之間相互作用集合的特征。這對于生物學家來說是陌生的，但將來會習慣這樣的描述。

6TCM生物學

TCM生物學家用生物學微觀實驗手段，即分子與細胞生物學、網(wǎng)絡(luò)工程、生物學工程、生物物理學等[8-11]，模擬與解釋TCM的基本理論。需要生物工程、網(wǎng)絡(luò)工程與程序工程等共同參與形成綜合性科學。TCM把“天體”對生物體的影響都考慮進去了，在疾病診治基本原則的基礎(chǔ)上還考慮了季節(jié)變化。即冬天益氣活血，溫腎助陽；春天滋陰潤肺，滋腎柔肝；夏天養(yǎng)心安神，清熱解毒；秋天健脾溫腎，滋陰補血。TCM早已認識到天體變化對人體的影響，并應(yīng)用在臨床實踐中。至于經(jīng)絡(luò)到底是什么還沒有誰在人體內(nèi)剖析出來，但臨床工作中銀針證實了它的存在，并以唯物主義的客觀事實傳承下來，如何完善它是今后研究的方向。

7TCM診療技術(shù)

TCM的基礎(chǔ)理論與臨床診療技術(shù)是根本，特別是中草藥、民間醫(yī)學很多精髓尚未開發(fā)。如西醫(yī)治療感冒居高不下的體溫(40℃)什么手段都用上了，TCM一付湯藥就能控制體溫即治愈。腫瘤壓迫所致的面神經(jīng)麻痹，TCM不用開刀減壓針灸就能矯正，這說出來好象不可思議但TCM做到了，TCM就是這么神氣有待進一步挖掘。TCM不僅應(yīng)懂得自身的基礎(chǔ)理論，并從生物學角度解釋出來，讓世人相信TCM接受TCM，讓TCM走向世界。

參考文獻

第5篇：細胞的生物學特性范文

關(guān)鍵詞：神經(jīng)生長因子受體；PRL瘤；生物學特性

PRL瘤是臨床常見的具有高分泌功能的良性腫瘤，約占所有垂體腺瘤的40%～60%[1]，其主要臨床表現(xiàn)為閉經(jīng)、溢乳、不孕（育）、高泌乳素血癥、垂體占位性病變。既往研究認為神經(jīng)生長因子（NGF）對PRL瘤有負性調(diào)節(jié)作用[2]，本研究旨在探討PRL瘤表達p75-NGFR與其生物學特性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2008年2月～2013年10月我院收治的82例PRL瘤患者作為研究對象，其中男性37例，女性45例；年齡19～65歲，平均（38.1±8.5）歲；術(shù)前泌乳素水平300～600 ng/ml 26例，100～300ng/ml 40例，50～100ng/ml 16例；腫瘤體積5.6～47.2 mm3，平均（16.7±7.5）mm3；腫瘤直徑≤10 mm 27例，腫瘤直徑>10 mm 55例；非侵襲性腫瘤45例，侵襲性腫瘤37例。

1.2方法

1.2.1 p75-NGFR表達檢測 ①標本處理及免疫組化：PRL瘤組織標本均常規(guī)石蠟包埋，作5 mm連續(xù)切片，用抗生蛋白鏈菌素生物素復合體（SABC）法作免疫組化染色。以PBS代替一抗為陰性對照，用已知的陽性片為陽性對照。②計算標記指數(shù)：在光學顯微鏡400倍視野下，每張切片隨機取10個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，總共計數(shù)1000個細胞。標記指數(shù)=（1000個細胞內(nèi)染色為陽性的細胞數(shù)/1000）×100%。③結(jié)果判斷：標記指數(shù)

1.2.2 PRL瘤侵襲性判斷標準[3] 有下列情況之一者認為腫瘤具有侵襲性：①術(shù)前影像學檢查顯示腫瘤包繞單側(cè)或雙側(cè)頸內(nèi)動脈，或侵入海綿竇生長；②術(shù)中可見鞍底骨質(zhì)破壞；③術(shù)后鞍底硬膜送檢有腫瘤細胞浸潤。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料用百分率（%）表示，計量資料用均數(shù)±標準差（MEAN±SD）表示。p75-NGFR表達陽性率比較采用四格表χ2檢驗，ALD比較采用成組設(shè)計t檢驗，P

2 結(jié)果

2.1 PRL瘤患者p75-NGFR表達陽性率 82例PRL瘤患者，32例p75-NGFR表達陽性，陽性率為39.0%。

2.2 p75-NGFR與PRL瘤生物學特性的關(guān)系 男性組與女性組p75-NGFR表達陽性率、ALD相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；血清泌乳素≤300 ng/ml組p75-NGFR表達陽性率、ALD顯著高于血清泌乳素>300 ng/ml組（P10mm組（P

3 討論

垂體腺瘤是目前臨床上常見的良性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的10%，在顱內(nèi)腫瘤中僅低于腦膠質(zhì)細胞瘤與腦膜瘤[4]。根據(jù)細胞分泌功能分類法，垂體腺瘤可以分為PRL瘤、生長激素垂體腺瘤、促腎上腺皮質(zhì)激素垂體腺瘤等，其中以PRL瘤最為常見。值得注意的是，臨床上可見部分PRL瘤患者呈侵襲性生長且生長速度快，術(shù)后很快就出現(xiàn)復發(fā)，并且易并發(fā)垂體瘤卒中，但是其發(fā)生機制至今尚未完全明確[5]。

NGF是第一個發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)家族成員，它通過結(jié)合NGFR發(fā)揮維持與促進神經(jīng)元細胞的存活、分化、成熟的作用。NGFR可以分為高親和力受體、低親和力受體兩大類，本研究中p75-NGFR是一個分子量為75kD的跨膜糖蛋白，屬于NGF的低親和力受體，它可結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)家族每一個成員，其主要作用是調(diào)節(jié)酪氨酸激酶活性，促進NGF結(jié)合高親和力受體TrkA，誘導細胞凋亡等[6]。有研究認為PRL瘤表達p75-NGFR明顯高于其他類型垂體腺瘤[7]，但有關(guān)PRL瘤表達p75-NGFR與其生物學特性關(guān)系的研究較少見。為此，本研究共分析82例PRL瘤患者，結(jié)果顯示32例p75-NGFR表達陽性，陽性率為39.0%。通過進一步分組、對比分析，結(jié)果顯示男性組與女性組p75-NGFR表達陽性率、ALD相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；血清泌乳素≤300 ng/ml組p75-NGFR表達陽性率、ALD顯著高于血清泌乳素>300 ng/ml組（P10mm組（P

參考文獻：

[1]Vozniak OM.Technical peculiarities of trans-sphenoidal surgical interventions for prolactin-secreting pituitary adenoma[J].Klin Khir，2013，32（10）：59-62.

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第6篇：細胞的生物學特性范文

《中國藥典》（2010年版）三部收載的生物技術(shù)類制品包括：EPO、IFNα1b、IFNα2a、IFNα2b、IFNγ、白細胞介素-2、G-CSF、GM-CSF、牛堿性成纖維細胞生長因子（BFGF）、人表皮生長因子（EGF）、SK等[3]；生長激素，胰島素、阿替普酶等品種由《中國藥典（2010年版）二部》收載[4]?！稓W洲藥典》與《中國藥典》的編制體例有所不同。針對生物技術(shù)類制品，《歐洲藥典》制定了“重組技術(shù)制品總論”，闡述了生物技術(shù)類制品的定義、特性，并對生產(chǎn)工藝、過程控制提出了明確要求，是建立品種標準的基礎(chǔ)和技術(shù)依托。在品種各論中，對產(chǎn)品的原液或原料藥的質(zhì)量標準制定了具體要求。《中國藥典》則在“凡例”和“通則”中，對各類產(chǎn)品的共性技術(shù)要求進行統(tǒng)一規(guī)定，在產(chǎn)品各論中，分別從原液、中間品到成品的質(zhì)量標準和檢定進行了具體規(guī)定。結(jié)合我國生物技術(shù)類制品現(xiàn)狀及研發(fā)趨勢，有必要參照《歐洲藥典》，制定“生物技術(shù)類制品總論”，并收載于2015年版《中國藥典》。

生物技術(shù)類制品質(zhì)量控制的主要因素

就生物技術(shù)類制品的質(zhì)量控制而言，生物學活性測定、理化特性分析和標準物質(zhì)的研究建立是十分重要的因素。生物學活性測定目前，生物技術(shù)類制品的生物學活性測定基本采用細胞增殖法。比較兩部藥典，最主要的差別在于檢測結(jié)果的統(tǒng)計學分析，例如：可信限的設(shè)置?！吨袊幍洹穼Υ朔矫娴囊?guī)定尚不完善。生物檢定是以藥物的藥理作用為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計為工具，運用特定的實驗設(shè)計，在一定條件下比較供試品和標準品所產(chǎn)生的特定反應(yīng)，通過等反應(yīng)劑量間比例的運算或限制劑量引起的生物反應(yīng)程度，從而測定供試品的效價、生物活性或雜質(zhì)引起的毒性[4]。由此可見，統(tǒng)計方法在生物學活性測定中的重要意義?！吨袊幍洹罚?015年版）三部擬收錄“生物檢定統(tǒng)計法”，進一步完善制品生物檢定結(jié)果的統(tǒng)計學分析。理化特性分析《歐洲藥典》對制品的理化特性分析得比較清晰明確，每個制品均標注了蛋白質(zhì)一級序列、二硫鍵的具置以及化學結(jié)構(gòu)式。蛋白質(zhì)的理化特性分析一般包括含量測定、純度分析、鑒別分析等項目。含量測定《中國藥典》附錄中規(guī)定的總蛋白檢測的方法多采用Lowry法，以人或牛白蛋白為標準品。人或牛白蛋白標準品為非同質(zhì)標準品，其氨基酸組成、化學結(jié)構(gòu)均與供試品不同，測量中引入了系統(tǒng)誤差，無法與同類進口產(chǎn)品的質(zhì)量進行比對分析，不利于制品質(zhì)量與國際接軌?！稓W洲藥典》一般采用紫外分光光度法和高效液相色譜法（HPLC），并采用同質(zhì)標準品進行蛋白質(zhì)含量測定。純度分析純度分析即用限量標準控制制品中非藥效活性成分。《中國藥典》主要以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳法、HPLC進行控制。純度分析應(yīng)盡量依據(jù)蛋白質(zhì)不同的理化特性，選擇分析原理不同的檢測方法，二者相互補充。G-CSF、GM-CSF、BFGF、EGF、SK質(zhì)量標準中采用分別基于蛋白質(zhì)分子大小和疏水特性的SDS-PAGE電泳法、反相高效液相色譜法（RP-HPLC）進行分析；其余質(zhì)量標準均以SDS-PAGE電泳和分子篩這兩個基于一種分析原理的檢測方法對純度進行控制?！吨袊幍洹穼χ魉幍鞍椎暮孔鞒隽讼拗狄蟆！稓W洲藥典》對于制品的純度分析較為詳細，針對不同的分子采用不同的分析方法和具體的判定標準。以IFNγ1b為例，純度分析包括了共價二聚體和低聚物、單體和多聚體、脫?；脱趸?、異質(zhì)二聚體、正亮氨酸及其他雜質(zhì)的限量要求；分別采用了分子排阻色譜法、離子交換色譜法、還原-非還原電泳法、高效液相氨基酸分析法。對于SDS-PAGE電泳等分辨率相對較低的方法，設(shè)立相應(yīng)控制帶以提高限量判定的準確度。《歐洲藥典》純度分析大致分為制品相關(guān)雜質(zhì)、工藝相關(guān)雜質(zhì)、相關(guān)物質(zhì)分析。制品相關(guān)雜質(zhì)產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)是在生產(chǎn)和/或貯存過程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。其分子量、生物學活性、有效性和安全性均不同于主藥蛋白[5]。工藝相關(guān)雜質(zhì)工藝相關(guān)雜質(zhì)是生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的，可能源自工程菌/工程細胞（殘余蛋白質(zhì)、殘余DNA）、培養(yǎng)基（誘導劑、抗生素、培養(yǎng)基成分）或者下游工藝（試劑、層析過程產(chǎn)生的雜質(zhì)）[5]。同一制品的不同生產(chǎn)單位，由于其工藝、表達系統(tǒng)的差異，殘余宿主細胞的DNA、蛋白無論從結(jié)構(gòu)還是組成比例均會存在差異。因此，檢測方法在標準物質(zhì)的選擇、抗原、抗體的制備方式均具有特異性。根據(jù)“質(zhì)量源于設(shè)計”理念，采用生產(chǎn)單位根據(jù)工藝自行制備的標準物質(zhì)和檢測用試劑對工藝相關(guān)雜質(zhì)進行控制，更為真實客觀，對于工程控制也更有意義。制品相關(guān)物質(zhì)制品相關(guān)物質(zhì)是在生產(chǎn)或貯存過程中，產(chǎn)生的不同于主藥蛋白的分子，其具有的生物學活性，對于制品的安全性和有效性沒有影響。它們的特性與主藥蛋白相似，不被認為是雜質(zhì)[5]。鑒別分析在理化鑒別方面，《中國藥典》與《歐洲藥典》的差距主要是在理化對照品方面?！吨袊幍洹肥蛰d的生物技術(shù)類制品標準尚未提供理化對照品。以肽圖分析為例，肽圖分析是國內(nèi)外藥典用于評價產(chǎn)品一致性和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的技術(shù)手段?！稓W洲藥典》采用全面結(jié)構(gòu)鑒定和理化分析的對照品作為鑒別判定依據(jù)，在儀器分析總體要求的基礎(chǔ)上，《歐洲藥典》對色譜柱粒徑、長度、柱溫，以及系統(tǒng)適用性中保留時間、分辨率等均有詳盡的描述，并采用非線性色譜梯度分離?！吨袊幍洌?010版）》也采用了酶切后RP-HPLC的方式，但尚未提供完成全面結(jié)構(gòu)鑒定和理化分析的對照品，其次在方法要求細節(jié)與系統(tǒng)適用性方面也存在一定差距。2.3標準品的建立標準物質(zhì)的研究和建立是藥品質(zhì)量控制的重要組成部分。《歐洲藥典》收錄藥品標準的鑒別、理化特性分析、生物學活性測定中，絕大多數(shù)檢驗方法均有標準物質(zhì)作為技術(shù)依托。然而，目前我國在相關(guān)生物技術(shù)類制品的質(zhì)量控制中，僅可以提供生物學活性標準品，但在理化分析、含量測定方面的標準物質(zhì)的研發(fā)還有待加強，在體制和機制上確保實物標準和文本標準同步發(fā)展與實施，完善標準物質(zhì)國家數(shù)據(jù)庫。

藥典相關(guān)標準比較

僅以EPO、G-CSF原液（原料藥）的質(zhì)量標準為例，對照分析中外藥典中相關(guān)檢定項目的技術(shù)要求。《歐洲藥典》收載的生物技術(shù)類制品原液按原料藥管理，有批準文號。而在我國，原液是禁止在市場流通的。詳見表（表略）

第7篇：細胞的生物學特性范文

方法：對289例胃癌根治術(shù)患者3年和5年生存率、復發(fā)原因進行對照分析。

結(jié)果：對高惡度胃癌擴大手術(shù)范圍和提高預(yù)防性治療級別，可提高治療效果。

結(jié)論：

胃癌治療應(yīng)根據(jù)其生物學特性及病理學分型，采用合適的手術(shù)范圍及術(shù)前、術(shù)中化療等措施，可明顯延長生存期，改善生存質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：胃腫瘤胃癌生物學特性病理學分型化學療法生存期

【中圖分類號】R4【文獻標識碼】B【文章編號】1008-1879（2012）12-0186-02

胃癌的腹膜種植轉(zhuǎn)移是胃癌根治術(shù)后復發(fā)的主要原因[1]，而胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移對胃癌的預(yù)后有一定的影響。作者對289例胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和漿膜脫落細胞進行研究，擴大手術(shù)范圍，采用術(shù)前、術(shù)中化療，以探討胃癌生物學特性與預(yù)后的關(guān)系，為預(yù)防術(shù)后復發(fā)、轉(zhuǎn)移，延長生存期，提高生存質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1資料和方法

1.1一般資料。1990年―1999年我院共施行進展期胃癌手術(shù)289例，男210例，女79例。年齡40～77歲，平均65歲。

1.2方法。胃癌手術(shù)開腹后探查前用100～150ml生理鹽水倒入腹腔上部或盆腔，輕輕攪動后收集沖洗液，離心沉淀，吸取有核細胞層涂片4～6張，以瑞氏法和蘇木精-伊紅染色鏡下觀察有無脫落細胞，并對沖洗液的有核細胞層懸液進行了臺盼藍染色觀察。

1.3病理學分型及分組。根據(jù)病理學分型，分為高分化腺癌組（n=135）、中分化腺癌組（n=83），低分化腺癌組（n=51）和其他病理類型組（n=20），回顧性分析術(shù)后3年和5年生存率、復發(fā)及死亡原因。

1.4術(shù)式及化療方案。根據(jù)腫瘤分期、部位、類型選擇D2、D3、D4式手術(shù)?；煼桨福盒g(shù)前選用FAM方案，術(shù)中溫生理鹽水420ml+5-Fu500mg腹腔灌注沖洗。

1.5統(tǒng)計學處理。用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，采用行×列表X2檢驗，P

2結(jié)果

2.13種分化胃腺癌患者不同術(shù)式及化療方案5年生存率的比較組內(nèi)與D2清除及D3、D4清除比較：P

2.2其他病理類型組生存情況其他3種類型胃癌病例較少，其中印戒細胞癌9例，黏液細胞癌7例，其他類型癌4例（包括未分化癌、不能分類的癌等）。這20例患者亦采用了以上幾種手術(shù)方式，經(jīng)統(tǒng)計，無論采用何種術(shù)式及術(shù)前、術(shù)中是否化療，生存期均未超過1年。

2.3胃癌死亡原因本組死亡病例共84例，其中腹腔廣泛種植轉(zhuǎn)移52例，肝轉(zhuǎn)移22例，其他原因10例。

3討論

胃癌的發(fā)病率及死亡率始終居消化系統(tǒng)惡性腫瘤之前列。當今胃癌的淋巴結(jié)清除范圍，應(yīng)根據(jù)患者的胃癌病期和癌腫的生物學特性加以區(qū)別對待。在此原則下，應(yīng)充分考慮到患者的諸多個體特點，優(yōu)選出合理的手術(shù)方案。對胃癌應(yīng)根據(jù)不同病理類型和不同的病期選擇合理的治療方案，術(shù)前對于病理類型的判斷尤為重要。很多研究表明新輔助化療可以提高進展期胃癌的手術(shù)切除率及改善預(yù)后，因而廣受重視。本組結(jié)果顯示，早期及高分化癌的手術(shù)根治率較高，行新輔助化療的意義不大，中晚期及高惡度胃癌則明顯可以看出其作用，故術(shù)前對患者進行腫瘤分期和明確病理類型極為重要。

許多文獻表明新輔助化療可以提高進展期胃癌的手術(shù)切除率及預(yù)后，因而廣受重視。早、中期胃癌手術(shù)切除治療率高，行新輔助化療的意義不大。腫瘤腹腔廣泛播散或遠處轉(zhuǎn)移者預(yù)后太差，也不應(yīng)納入其范疇內(nèi)。所以準確的術(shù)前術(shù)中分期對病例的術(shù)式選擇至關(guān)重要[2]。從本組可以看出，腫瘤細胞分化程度越低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多，腹膜種植轉(zhuǎn)移概率越高，說明其浸潤廣泛，對術(shù)后5年生存率有明顯的影響。胃癌新輔助化療有幾個優(yōu)勢：①可以殺滅術(shù)區(qū)以外的亞臨床轉(zhuǎn)移灶，預(yù)防醫(yī)源性腫瘤播散。②殺滅癌細胞，降低臨床分期，增加手術(shù)切除率或根治性切除的機會。③獲得腫瘤的個體藥敏資料，為術(shù)后選擇輔助化療提供依據(jù)。④腫瘤對化療的效果是判斷患者預(yù)后的指標之一。

腹膜種植轉(zhuǎn)移是胃癌患者術(shù)后最常見的復發(fā)形式，由于其早期診斷有一定困難，目前腹膜種植轉(zhuǎn)移復發(fā)患者尚無有效的治療方法。從死因可以看出，患者術(shù)后復發(fā)主要為腹膜種植轉(zhuǎn)移，術(shù)中預(yù)防醫(yī)源性癌細胞脫落尤為重要。術(shù)中應(yīng)注意無瘤操作技術(shù)，不用紗布擦拭手術(shù)野外的臟器，盡量減少暴露、擦拭、損傷腹膜，以免增加癌細胞的黏附因素；盡量防止血液流入腹腔，去除白細胞、血小板高黏附癌細胞的因素；同時腹腔灌注化療必不可少，優(yōu)點是腹腔內(nèi)藥物濃度高，可有效殺滅脫落的癌細胞。術(shù)前或術(shù)中證實有腹膜轉(zhuǎn)移患者，除術(shù)中化療以外，應(yīng)于術(shù)后輔以腹腔灌注化療及全身化療，可望減少術(shù)后腹膜種植復發(fā)率。

手術(shù)范圍的選擇也極為重要。一些學者認為擴大胃周圍淋巴結(jié)清除能夠提高患者術(shù)后5年生存率，并且淋巴結(jié)清除及病理學檢測對術(shù)后的正確分期判斷預(yù)后、指導術(shù)后監(jiān)測和選擇術(shù)后治療方案都有重要的價值。D3術(shù)式在高分化癌中，并不比D2能提高生存率，反而增加了手術(shù)風險，而對于低度分化癌中，D3術(shù)式則是明顯提高了5年的生存率，故根據(jù)病理切片類型選擇術(shù)式，對于胃癌的預(yù)后也有明顯的影響。從本組結(jié)果可以看出：高中分化腺癌行D2術(shù)式已能完成患者的治療，而D3術(shù)式并不比D2術(shù)式生存率高，術(shù)前化療及術(shù)中的腹腔化療并不能提高生存率，反而增加了患者的創(chuàng)傷。總之，在胃癌治療過程中，應(yīng)重視其生物學特性對預(yù)后的影響，結(jié)合病理診斷及其分期，采取不同的術(shù)式，術(shù)前術(shù)中采用不同的預(yù)防措施，可明顯延長患者的生存期及改善生存質(zhì)量。胃癌的治療選擇及預(yù)后取決于多種因素，本文僅從病理類型方面作了初步探討，其他因素的影響還有待深入研究。

參考文獻

第8篇：細胞的生物學特性范文

【Abstract】 AIM: To evaluate the biological safety of polypyrrole film electropolymerized on Tisubstrates for possible use as dental implant. METHODS: The biological safety was evaluated through the experiments including hemolysis test， shortterm systemic toxicity test， oral mucous membrane irritation test and cytotoxicity test (MTT test). RESULTS: The material had no hemolytic activities. The shortterm systemic toxicity test results showed that no histopathological changes were found in the vital organs such as heart， kidney and liver of tested animals. No local response was observed in the oral mucosa membrane irritation test. MTT revealed that L929 cells grew well in the extract and the grade of cytotoxicity was zero. CONCLUSION: The Tisubstrates coated with polypyrrole film have good biological safety.

【Keywords】 dental implants; polypyrrole; biological safety; biocompatible materials

【摘要】 目的： 評價純鈦表面聚吡咯涂層的生物安全性，為口腔種植體表面改性提供依據(jù). 方法： 分別通過溶血試驗、口腔黏膜刺激試驗、細胞毒性試驗（MTT法）和急性全身毒性試驗，初步評價純鈦表面聚吡咯涂層的生物安全性. 結(jié)果： 純鈦表面聚吡咯涂層材料無溶血現(xiàn)象，不影響凝血功能；短期全身毒性實驗的受試小鼠心、腎、肝的組織切片均未見病理變化；口腔黏膜刺激實驗未見異常組織學反應(yīng)；MTT試驗顯示L929細胞在涂層浸提液中生長良好，細胞毒性為0級. 結(jié)論： 純鈦表面聚吡咯涂層材料具有良好的生物安全性.

【關(guān)鍵詞】 牙種植體，聚吡咯，生物安全性，生物相容性材料

口腔種植修復是目前最具前景的義齒修復手段，如何在種植創(chuàng)愈合初期，促進成骨細胞在種植體表面早期地附著生長，完善地表達其成骨功能是提高種植體與骨組織結(jié)合效率的關(guān)鍵. 在純鈦種植體表面固定生物活性大分子能夠提高材料的生物相容性，使純鈦種植體既有骨傳導作用，又具備骨誘導活性. 然而作為金屬材料，純鈦表面不可能同高分子材料一樣具有豐富的反應(yīng)性功能基團來連接側(cè)鏈、配基或生物活性分子，這成為了制約純鈦種植體表面生物有機修飾的瓶頸［1］. 聚吡咯(Polypyrrole， PPy)，是一種能夠表現(xiàn)出半導體和導體的許多光、電、磁特性的導電高分子聚合物，能夠在金屬表面形成良好的結(jié)合［2-3］. 因此，在純鈦表面制備PPy涂層，有望增加其表面的有機修飾活性位點，提高口腔種植手術(shù)成功率. 我們利用對純鈦進行表面涂層改性，初步探索其生物安全性，為這一新型材料的后續(xù)應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ).

1材料和方法

1.1材料6 mo齡新西蘭大耳白兔1只，雄性，體質(zhì)量1.5 kg (第四軍醫(yī)大學實驗動物中心)，昆明成年小白鼠16只，體質(zhì)量18～22 g（第四軍醫(yī)大學實驗動物中心），60～70 d金黃色地鼠10只，體質(zhì)量140～160 g (西安交通大學動物實驗中心)，小鼠結(jié)締組織成纖維細胞L929 細胞株（第四軍醫(yī)大學口腔生物實驗室），鈦材TA2(Ti 西北有色金屬研究院)，對甲苯磺酸鈉(ToSNa，西安化學試劑廠)，Pyrrole(Py，美國Sigma公司)， 217型KCl飽和甘汞電極(上?；瘜W試劑廠)，ZF5型恒電位儀(上海正方電子電器有限公司)，JSM840型掃描電鏡(日本Jeol公司)，BX41型光學顯微鏡(日本 Olympus公司)，MPSUV260型紫外分光光度儀(日本 島津公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BioTek公司），DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco BRL公司），胎牛血清（浙江金華清湖犢牛利用研究所），胰蛋白酶（上海浦東生化試劑廠），MTT（美國Sigma公司）.1.2方法

1.2.1純Ti表面PPy涂層制備與表面形貌觀察將TA2加工成直徑18 mm，厚1 mm的圓型試件，金相砂紙從280#逐級打磨至800#. 激光焊接機將直徑0.3 mm Ti絲焊接于圓型試件側(cè)面，作為工作電極引線. 采用ZF5型恒電位儀在Ti試件表面恒電流電化學聚合PPy，聚合電流密度控制為1 mA/cm2. 電解液為0.1 mol/L對甲苯磺酸鈉、0.1 mol/L Pyrrole水溶液，pH值為4.0左右. Ti試件為工作電極，鉑片為對電極，217型KCl飽和甘汞電極為參比電極. 涂層厚度由聚合過程中通過的電量來計算. 每通過100 mC/cm2單位面積的電量大約生成0.28 μm厚度的PPy涂層［4］. PPy涂層厚度均控制為100 μm. 采用JSM840型掃描電鏡進行表面形貌觀察.

1.2.2溶血試驗將10個Ti表面PPy涂層試件無菌試管完全浸沒于20 mL DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃培養(yǎng)箱中72 h，獲得浸提液. 心臟穿刺抽取新西蘭大耳白兔血10 mL，立即加入20 g/L的草酸鉀0.5 mL，抗凝，取8 mL兔血加入10 mL生理鹽水中稀釋備用. 實驗分為3組，每組平行3份試樣. 陰性對照組： 0.2 mL稀釋兔血加入10 mL生理鹽水；陽性對照組：0.2 mL稀釋兔血加入10 mL三蒸水；涂層實驗組： 0.2 mL稀釋兔血加入10 mL浸提液. 37℃水浴60 min，離心，取上清. 在MPSUV260型紫外分光光度儀上測A540 nm值. 溶血率計算公式為：溶血率（%）=（實驗組A540 nm-陰性對照組A540 nm）/（陽性對照組A540 nm-陰性對照A540 nm）×100%. 溶血率大于5%則預(yù)示陽性結(jié)果.

1.2.3急性全身毒性試驗將PPy涂層用鋒利刀片從Ti表面刮下，研磨粉碎后高溫高壓消毒，無菌條件下配制成100 g/L生理鹽水混懸液，使用前37℃下保持1 h. 選用昆明小鼠隨機分配為Ti表面PPy涂層實驗組和陰性對照組，每組各8只. 實驗組采用胃內(nèi)針給藥，1 g/kg. 對照組給以等量的生理鹽水. 連續(xù)給藥7 d，停藥后繼續(xù)觀察7 d. 每日檢查動物的臨床中毒體征，并予以記錄. 停藥7 d后，采用頸椎脫臼法將動物處死. 取動物心、肝和腎，多聚甲醛固定，常規(guī)HE染色后BX41型光學顯微鏡下觀察.

1.2.4口腔黏膜刺激試驗將金黃色地鼠腹腔注射10 g/L的戊巴比妥鈉麻醉動物，消毒，鋪巾. 用醫(yī)用縫合線將試樣穿頰黏膜縫合固定到頰囊黏膜上，每只固定經(jīng)消毒備用的2個試樣，左側(cè)為實驗組Ti表面PPy涂層試件，右側(cè)為作為陰性對照的Ti試件. 術(shù)后每日觀察黏膜組織反應(yīng)及試樣在位情況，即試片周圍有無充血、糜爛、腫脹等. 術(shù)后14 d處死動物，取與材料接觸的頰囊部全層組織，HE染色，BX41型光學顯微鏡進行觀察.

1.2.5細胞毒性試驗按照CB/T16886.52003 《醫(yī)療器械生物學評價》體外細胞學毒性試驗的試驗方法進行［5］. 選擇L929細胞為受試細胞株，實驗前用PBS新鮮配制MTT溶液，微孔濾器過濾除菌，4℃保存. 取對數(shù)生長期的細胞系，常規(guī)胰酶消化后制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×106 L，接種細胞于96孔培養(yǎng)板（100 μL/孔，n=5），置于5 mL/L CO2， 37℃培養(yǎng)箱中，在飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h. 然后將浸提液加入各實驗組（150 μL/孔）. 陰性對照為DMEM培養(yǎng)基，陽性對照為1 mL/L苯酚，常規(guī)培養(yǎng). 培養(yǎng)12， 24， 48 h后酶聯(lián)免疫檢測儀測定A570 nm值，并計算出各組的A570 nm均值及細胞增殖百分率（P%）. P%=各濃度組A570 nm均值/陰性對照組A570 nm均值×100%. 按照CB/T16886.52003標準，P%可分為6級： >100%為0級；75%～100%為Ⅰ級；50%～74%為Ⅱ級；30%～49%為Ⅲ級；15%～29%為Ⅳ級；0～14%為Ⅴ級. 只有細胞毒性為I級或0級的生物材料才能用于體內(nèi)實驗.

2結(jié)果

2.1Ti表面PPy涂層掃描電鏡觀察高倍鏡下可見PPy涂層呈現(xiàn)典型的菜花樣、結(jié)節(jié)樣顆粒. 顆粒大小為0.5～1.5 μm左右，顆粒間的孔徑大多約在1～2 μm之間（圖1）.

圖1Ti表面聚吡咯涂層形貌SEM ×2000

2.2溶血試驗各測試組光吸收度測定值見表1，以每組測定值的平均數(shù)計算溶血程度，溶血程度為1.49%，小于5%，即Ti表面PPy涂層無溶血反應(yīng).

2.3短期全身毒性試驗所有小鼠在胃內(nèi)灌入混懸液后2 wk內(nèi)一般情況良好，活動、進食情況正常，體質(zhì)量無下降，無步態(tài)不穩(wěn)、驚厥、癱瘓、呼吸困難等不良反應(yīng)，無死亡. 各組小鼠心、腎、肝的組織切片均未見細胞變性、壞死等病理變化，實驗組與對照組無差異.表1各實驗組光吸收度測定值 2.4口腔黏膜刺激試驗各組金黃色地鼠進食、飲水正常，毛發(fā)光澤，反應(yīng)靈活. 肉眼觀察，材料接觸處口腔黏膜表面未見明顯充血、腫脹、糜爛或潰瘍. 組織切片觀察，Ti陰性對照組，頰黏膜的黏膜上皮排列整齊，細胞形態(tài)正常，較少量炎性細胞浸潤，黏膜下結(jié)締組織中有少量血管擴張和充血. Ti表面PPy涂層實驗組頰黏膜各層細胞排列整齊，較少量炎性細胞浸潤，黏膜下結(jié)締組織中有少量血管擴張和充血（圖2）. 實驗組與陰性對照組的組織學觀察結(jié)果相似，均未見明顯異常反應(yīng).圖2Ti表面聚吡咯涂層植入頰黏膜后組織反應(yīng)×100

2.5細胞毒性實驗結(jié)果各組A570 nm值，細胞增殖率及細胞毒性分級見表2. 倒置相差顯微鏡觀察陽性對照組，正常細胞形態(tài)消失，核固縮或溶解，而實驗組細胞形態(tài)良好，細胞折光性強，與陰性對照組相似，并可見多個分裂相細胞，表明細胞生長旺盛. 細胞毒性測試為0級，說明Ti表面PPy涂層對L929細胞無抑制作用.表2各實驗組細胞增殖率及細胞毒性分級

3討論

純鈦種植體在體內(nèi)，直接也是最先與組織、細胞相接觸的是材料的表面. 材料的表面性質(zhì)影響細胞的吸附、增殖、分化等一系列反應(yīng). 學者們一直致力于將一些有生理功能的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多肽、酶和細胞生長因子等固定在純鈦種植體表面，充當鄰近細胞、基質(zhì)或可溶性因子的配基或受體. 這種在種植材料表面引入具有誘導骨組織再生的活性因子、細胞或活體組織的方法稱為生物材料表面有機修飾. 它能夠極大地改善材料的生物學性能，是實現(xiàn)材料良好生物誘導活性的根本途徑［5-6］. 然而，金屬材料表面與高分子材料完全不同的性質(zhì)決定了其幾乎不存在任何反應(yīng)性功能基因來連接側(cè)鏈、配基或生物活性分子，這是鈦基金屬表面生物有機修飾的技術(shù)難點.

長期以來，高分子一直被視為結(jié)構(gòu)材料和絕緣材料. 1971年日本化學家白川英樹在用齊格勒―納塔催化劑合成聚乙炔時發(fā)現(xiàn)，當聚乙炔與I2，AsF5等反應(yīng)之后，電導率達到1×102～1×103 S/cm. 傳統(tǒng)意義上的絕緣體竟然表現(xiàn)出半導體和導體的許多光、電、磁特性，這對經(jīng)典的材料分類法和導電理論是巨大的挑戰(zhàn)和突破，也意味著新的一代功能高分子的誕生. 鑒于這類聚合物表現(xiàn)出的傳統(tǒng)高分子材料所不具備的導體、半導體、鐵磁體、發(fā)光體等的特性，這類功能高分子被稱為導電聚合物（conducting polymers）或合成金屬（synthetic metals）. PPy就是其中發(fā)現(xiàn)較早并經(jīng)過系統(tǒng)研究的導電聚合物之一［7］. 因此，我們試圖通過PPy的導體特性同鈦金屬基底形成良好的結(jié)合，同時又利用高分子材料表面反應(yīng)性功能基因豐富的特性來進行生物材料表面有機修飾，從而增強鈦種植體的生物活性.

對生物材料安全性的評價方法較多，國際標準化組織公布的醫(yī)療器械生物學評價試驗指南(ISO標準，1997)中基本評價的生物學試驗包括細胞毒性、致敏、刺激或皮內(nèi)反應(yīng)、全身急性毒性、亞慢性亞急性毒性、遺傳毒性、植入、血液相容性等［8-9］. 我們選擇了溶血實驗、短期全身毒性實驗、口腔黏膜刺激實驗和細胞毒性試驗4種較為常見的生物學試驗方法. 其中細胞毒性檢測采用MTT試驗法，原理為MTT可被線粒體上的脫氫酶還原成藍紫色結(jié)晶，經(jīng)有機溶劑二甲基亞砜等溶解后可使用分光光度計測定MTT結(jié)晶物的染色濃度，從而評價細胞的增殖率和死亡率，操作簡便、快速，能夠靈敏反映細胞受損害的程度. 我們的結(jié)果表明純鈦表面聚吡咯涂層材料不引起溶血反應(yīng)，不干擾細胞功能，對口腔黏膜顯示無刺激性，無短期毒性作用，具有可靠的生物安全性，是一種具有良好生物相容性的材料，具有進一步應(yīng)用于鈦種植體材料表面改性研究的廣闊前景.

【參考文獻】

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［3］ Idla K，Ingans O， Strandberg M. Good adhesion between chemically oxidised titanium and electrochemically deposited polypyrrole［J］. Electrochimica Acta， 2000， 45(13):2121-2130.

［4］ Zalewska T， Lisowska O， Biallozor S， et al. Polypyrrole films polymerized on a nickel substrate ［J］. Electrochimica Acta， 2000，45(24):4031-4040.

［5］ Hanawa T. In vivo metallic biomarerials and surface modification［J］. Mater Sci Eng A， 1999， 267(23): 260-266.

［6］ Rβler S， Scharnweber D， Worch H. Immoblization of typeⅠcollagen on the alloy Ti6Al4V ［J］. J Mater Sci Let， 1999，18(7):577-579.

［7］ 何天白， 胡漢杰. 功能高分子與新技術(shù)［M］. 北京: 化學工業(yè)出版社， 2001:110-118.

第9篇：細胞的生物學特性范文

[關(guān)鍵詞]外泌體;分離;鑒定;差速離心法

中圖分類號：TU755 文獻標識碼：A 文章編號：1009-914X（2016）24-0193-01

近年來，越來越多的證據(jù)表明外泌體對于細胞生物學以及醫(yī)學研究方面具有重要的價值，而由于外泌體的體積結(jié)構(gòu)方面的因素，其分離純化還存在很大的困難，目前比較常用的分離方法有差速離心法、密度梯度離心法、超濾離心法、免疫磁珠法、多聚物沉降法等。

1.差速離心法

陳紹倩[1]等人以白血病細胞系K562細胞為材料，采用多步離心的方法成功地提取到了的外泌體。此種實驗方法操作不是很復雜，實驗設(shè)備要求相對簡單，擁有超速離心機和細胞培養(yǎng)設(shè)備即可，是一種比較簡便的提取外泌體的方法，基本可以滿足實驗研究的要求。但分離純度不是很高，并且經(jīng)過多次離心對外泌體的理化性質(zhì)造成一定的影響。

2.密度梯度離心法

像所有的脂質(zhì)小囊泡一樣， 外泌體懸浮于特定密度梯度的蔗糖中，其密度范圍從 1.13g/ml到1.210g/ml，將細胞混懸液或勻漿置于蔗糖介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離，從而將外泌體從混雜的物質(zhì)如蛋白聚集物或細胞凋亡的核小體碎片等中分離出來[2]。崔焱[3]等人根據(jù)其這一特性，從大量培養(yǎng)的腫瘤細胞上清中分離純化外泌體，并對此進行了電鏡鑒定;在得到大量較高純度的外泌體的基礎(chǔ)上，將其加入含有白細胞介素-2（1L-2）的淋巴細胞培養(yǎng)體系中，觀察其對淋巴細胞增殖的影響。

3.超濾離心法

王偉[4]等人以樹突狀細胞為實驗材料，基于對外泌體物理特性，大小以及密度的了解，將超濾離心分離外泌體的方法與傳統(tǒng)的分級離心法進行了比較，通過實驗證明超濾離心法耗時少，產(chǎn)量和純度都得到了很大程度的提高，是一種比較高效的制備外泌體的方法。

4.免疫磁珠法

將具有磁性的磁珠表面包被特殊的抗體，細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性抗體結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由于不能與磁珠結(jié)合而不能在磁場中停留，從而使細胞得以分離。Richard Wubbolts[5]等人在對外泌體進行蛋白質(zhì)組學和生化分析的過程中，將外泌體的標志性蛋白―抗MHCII抗體包被于磁珠表面，通過抗原抗體特異性識別的特性有效的將外泌體分離出來。

無論采用哪種方法進行分離，如果想對其進行系統(tǒng)的研究都必須首先確定分離得到的產(chǎn)物是不是外泌體，其次要鑒定外泌體是否達到實驗所要求的純度和數(shù)量。因此，外泌體的鑒定是必不可少的。目前，常用的鑒定方法主要有電子顯微鏡觀察、動態(tài)光散射技術(shù)、Western blot、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)等。

其中電子顯微鏡觀察法是從形態(tài)和大小上對外泌體進行鑒定，但由于電鏡拍攝視野有限，因此這種方法只能對個別外泌體進行觀察。而動態(tài)光散射技術(shù)則是從整體上對外泌體大小的分布情況進行檢測，具有準確、快速、可重復性好等優(yōu)點，但對于多分散的復雜外泌體樣本的測量還存在一定的問題。Western blot則是通過抗原抗體特異性結(jié)合的原理，對外泌體中的標志蛋白進行檢測，從蛋白質(zhì)組學方面對外泌體進行鑒定。

隨著科學技術(shù)的發(fā)展，納米顆粒跟蹤分析技術(shù)逐漸成為外泌體鑒定的新技術(shù)，不但可以實時對外泌體進行觀測，同時還可以對每個顆粒的布朗運動進行追蹤和分析，從而計算出外泌體半徑和濃度。

外泌體作為細胞間物質(zhì)信息的傳遞者，在細胞生物學以及分子生物學領(lǐng)域中，扮演著越來越重要的角色。因此，提高外泌體的分離純度，改進外泌體的分離方法尤為重要。目前，雖然外泌體的分離與鑒定已經(jīng)擁有系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)，但實際操作起來依然存在很多困難，無論是哪種方法，都有各自的優(yōu)點和缺點，因此只有將各個方法有效的結(jié)合起來，例如差速離心法與免疫磁珠法、電鏡法與Western blot結(jié)合使用，才能達到更好的分離鑒定效果。

參考文獻：

[1] 陳紹倩，杜英，王 鑫，顧巧麗，黃玉敏，董子明.多步離心法提取K526細胞外泌體.鄭州大學學報（醫(yī)學版） ，2006，41（3）.

[2] Thery C，Zitvogel L，Amigorena S.Exosomes：composition，biogenesis and function.Nat Rev Immunol，2002，2：569-579.

[3] 崔焱，于津浦，李慧，楊莉莉，魏楓，安秀梅，任秀寶.腫瘤細胞來源胞外體的分離鑒定與功能檢測.天津醫(yī)藥，2009，37（12）.