間質(zhì)干細(xì)胞移植治療POF的研究進(jìn)展

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MSCs治療優(yōu)勢及其應(yīng)用

1966年Friedenstein等［2］首先從骨髓中發(fā)現(xiàn)MSCs，是來源于中胚層的成體干細(xì)胞，廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。MSCs在體外長期培養(yǎng)的過程中始終保持多向分化潛能，而且易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增及外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)，免疫原性弱，具有強(qiáng)大的遷移能力。其分泌的多種細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)免疫、支持造血的特性，對于修復(fù)組織缺陷或損傷有獨特的優(yōu)勢，遺傳背景穩(wěn)定，且不受胚胎干細(xì)胞研究中遇到的倫理問題限制。因此，MSCs在細(xì)胞治療、基因治療及組織工程中得到廣泛的應(yīng)用。目前研究較多的是骨髓MSCs、外周血MSCs、臍帶MSCs、胎盤MSCs及羊水MSCs。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是存在于骨髓微環(huán)境中的一種成體干細(xì)胞，來源于發(fā)育早期的中胚層，是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞。動物實驗及臨床研究證實，BMSCs可促進(jìn)損傷組織結(jié)構(gòu)及功能的修復(fù)，用于治療腦、脊髓、心肌、皮膚及頜面部等多種損傷性疾病，臨床已取得滿意療效［3－5］。但成人BMSCs存在病毒高度污染的可能和潛在的致瘤性，隨著年齡增長其細(xì)胞數(shù)量和擴(kuò)增、分化能力呈明顯下降趨勢，且供者BMSCs采集須行骨髓穿刺術(shù)，因患者易感染、體質(zhì)較弱等因素限制了自體BMSCs移植的應(yīng)用。近年來，自體外周血干細(xì)胞(peripheralbloodstemcells，PBSC)移植已成為繼自體骨髓移植之后治療惡性血液病、免疫缺陷性疾病和某些實體腫瘤的又一有效輔助方法，在治療神經(jīng)、心血管系統(tǒng)疾病等方面也取得滿意療效。PBSC具有更強(qiáng)的增殖能力、造血及免疫功能恢復(fù)快、來源及采集方便及痛苦小等優(yōu)點。但外周血的祖細(xì)胞和多能造血干細(xì)胞只占骨髓細(xì)胞的1/104～1/105，需用血細(xì)胞分離器采集多次，同時需借助造血干細(xì)胞動員劑，使骨髓或其它部位的造血干細(xì)胞進(jìn)入血流，以提高外周血造血干細(xì)胞的單次采集效果。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells，UCMSCs)的研究是傳統(tǒng)BMSCs的新生力量，UCMSCs多數(shù)生物學(xué)特征與BMSCs相似，但其增殖能力、CFU-F頻率、CD106、HLA-Ⅰ表達(dá)和神經(jīng)誘導(dǎo)分化能力等優(yōu)于BMSCs。同時臍帶來源廣泛，便于取材，對供者無不利影響，不影響臍帶造血干細(xì)胞的保存，無道德倫理限制［6］，且其干細(xì)胞輸注相關(guān)的病毒和病原微生物感染率遠(yuǎn)低于BMSCs移植，是一類免疫缺陷細(xì)胞，不需經(jīng)過嚴(yán)格配對，異體移植無免疫排斥反應(yīng)或反應(yīng)較弱，適于不同個體之間移植且易于轉(zhuǎn)染外源基因。目前已用于治療神經(jīng)退行性疾病帕金森綜合癥、肺纖維化修復(fù)、類風(fēng)濕、腎損傷、大腸炎、改善肝硬化后肝功能、抑制乳腺癌等領(lǐng)域以及作為基因治療載體細(xì)胞［7－10］。因此，作為一種新型種子細(xì)胞，UCMSCs的應(yīng)用具有更廣闊的前景。另外，目前發(fā)現(xiàn)通過各種體外誘導(dǎo)方法，可使胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(placentalmesenchymalstemcells，PMSCs)可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞［11］。PMSCs來源廣泛，供者無痛苦，污染機(jī)會少，分化能力較佳，增殖迅速，具有更強(qiáng)的長期增殖能力。Prusa等［12］首次證實，羊水細(xì)胞表達(dá)Oct-4轉(zhuǎn)錄因子，Oct-4被認(rèn)為是鑒定多潛能干細(xì)胞的標(biāo)志性基因。羊水來源干細(xì)胞同樣具有多向分化潛能，培養(yǎng)條件適當(dāng)可以分化出內(nèi)胚層、中胚層、以及外胚層3個胚層的細(xì)胞［13］。近年羊水干細(xì)胞在組織工程學(xué)領(lǐng)域的研究有了新的突破，包括成功地構(gòu)建了組織工程骨［14］、人工心瓣膜的體外培育［15］及異體移植后聯(lián)合高壓氧療促進(jìn)受損神經(jīng)生長［16］等多個方面。羊水取材簡便，既可在產(chǎn)前診斷時經(jīng)羊膜穿刺獲取，也可在分娩過程中收集。不會對母親和胎兒造成傷害，安全性高，且不涉及倫理問題。

MSCs治療卵巢早衰

近年來采用骨髓、臍帶和羊水來源MSCs移植治療化療藥物、免疫性卵巢炎、半乳糖和化學(xué)因子誘導(dǎo)的pof取得了明顯效果。MSCs原位、腹腔或靜脈注射后，可遷移、定植于卵巢，并在卵巢存活、生長，可恢復(fù)實驗動物卵巢形態(tài)、大小和正常動情周期，增加卵巢各級卵泡數(shù)，促進(jìn)顆粒細(xì)胞生長，抗顆粒細(xì)胞凋亡，改善卵巢內(nèi)分泌功能，恢復(fù)受孕。

1體外研究

體外研究分析干細(xì)胞治療作用的機(jī)理，目前主要研究干細(xì)胞與卵巢顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測其是否可抑制卵巢顆粒細(xì)胞調(diào)亡。POF主要的病理學(xué)表現(xiàn)為顆粒細(xì)胞凋亡，而凋亡調(diào)控涉及多種基因和蛋白，包括Bcl-2基因(B-celllymphoma/leu-demia-2，淋巴細(xì)胞瘤/白血病基因-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、細(xì)胞型Flice抑制蛋白(cellular-Flicelikeinhibitoryprotein，cFLIP)、P53等［17－18］。Bcl-2可以通過線粒體途徑抑制卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，而Bax則可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。cFLIP在健康卵泡中高表達(dá)而在閉鎖卵泡中低表達(dá)，推測其具有抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡作用［18］。一些細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、胰島素樣生長因子-1(insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)等也參與了凋亡調(diào)控過程［19－20］。體外培養(yǎng)BMSCs發(fā)現(xiàn)，其分泌的多種細(xì)胞因子如VEGF、HGF、IGF-1、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basicfi-broblastgrowthfactor，b-FGF)等，可減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)上皮增生及血管生成，抑制炎癥反應(yīng)［21－22］。付霞霏等［23］研究報道，顆粒細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)后，BMSCs能上調(diào)Bcl-2基因在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)，并分泌具有抗凋亡作用和促血管生成的細(xì)胞因子，如VEGF，IGF-1和HGF，顆粒細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞存活率上升，BMSCs細(xì)胞數(shù)越多，凋亡率越低，呈現(xiàn)數(shù)量依賴性。陳芳等［24］在體外實驗發(fā)現(xiàn)，UCMSCs具有抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用。

2動物實驗及體內(nèi)研究

由于POF的病因尚不清楚，目前仍沒有非常理想的POF動物模型。因化療藥物造模具有動物取材容易、病理結(jié)果與人一致、可用藥物逆轉(zhuǎn)、操作容易且造模投入人力和時間相對較少等優(yōu)點，是目前常見卵巢早衰造模模型。目前研究主要針對化療藥物造模方式導(dǎo)致的卵巢早衰，觀察移植干細(xì)胞的存活遷移情況，探討MSCs移植對卵巢損傷大鼠卵巢結(jié)構(gòu)、功能的影響及其可能作用機(jī)制，為進(jìn)一步的研究和臨床治療提供實驗依據(jù)。Lee等［25］報道，移植綠色熒光標(biāo)記的BMSCs至環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的POF小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)小鼠卵巢內(nèi)未成熟卵泡數(shù)量顯著提高，且其遠(yuǎn)期生殖能力也有所改善。隨后研究［23］發(fā)現(xiàn)，大鼠BMSCs的卵巢局部移植對化療所致的卵巢早衰有明顯的治療作用，表現(xiàn)為大鼠卵巢各級卵泡數(shù)增加，E2濃度明顯上升，F(xiàn)SH濃度明顯下降，表明BMSCs能修復(fù)卵巢結(jié)構(gòu)，改善卵巢內(nèi)分泌功能。其機(jī)制可能與BMSCs能分泌VEGF、IGF-1、HGF等，抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡有關(guān)。賀衛(wèi)衛(wèi)等［26］也證實，BMSCs可促進(jìn)損傷卵巢功能修復(fù)，其機(jī)制可能是BMSCs通過腹腔血管進(jìn)入血液循環(huán)到達(dá)受損傷卵巢，利用其多向分化潛能分化發(fā)育成受損傷的組織。BMSCs中可能還存在生殖干細(xì)胞，分化發(fā)育成各級卵泡及BMSCs可分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)損傷卵巢功能的修復(fù)。另有研究［27－28］發(fā)現(xiàn)，BMSCs在體內(nèi)能選擇性地遷移和停留在機(jī)體受損傷的組織，可能與MSCs表面表達(dá)的生長因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)受體有關(guān)，這些因子驅(qū)使移植的BMSCs遷移至炎癥部位。隨著BMSCs移植時間的推移，免疫損傷卵巢的各級卵母細(xì)胞逐漸增多，BMSCs移植4周后，卵巢各部分細(xì)胞形態(tài)均與正常卵巢相似;而且凋亡的顆粒細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明BMSCs對卵巢免疫損傷的修復(fù)有效。2010年埃及國家研究中心在德國舉行的世界生殖和不孕大會報告上報道，BMSCs使生育能力有缺陷的雌性實驗鼠的卵巢功能得到康復(fù)。最近一項研究用卵泡刺激素受體(FSHreceptor，F(xiàn)SHR)基因敲除的雌性小鼠模型來研究人類POF［29］，靜脈注射BMSCs后發(fā)現(xiàn)，小鼠成熟卵泡數(shù)及總卵泡數(shù)明顯增加，與對照組相比，血清FSH下降，雌激素增加，并在移植骨髓干細(xì)胞的小鼠卵巢內(nèi)檢測到FSHRmRNA，表明BMSCs可到達(dá)小鼠卵巢，并刺激卵巢分化和表達(dá)FSHR基因，使FSHR對FSH產(chǎn)生反應(yīng)，恢復(fù)卵泡的成熟發(fā)育和類固醇激素的生成，這為臨床上有生育要求的POF患者恢復(fù)受孕提供了可能。李彩霞等［30］研究UCMSCs發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)OCT4、Stella、Ifitm3等生殖系特異性標(biāo)記物，且將其移植到POF小鼠體內(nèi)后，具有向卵巢歸巢的能力，并能在局部存活生長，提示UCMSCs可能具有向生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)化的潛能及卵巢損傷修復(fù)的作用。冷少華等［31］報道UCMSCs移植到動物體內(nèi)后，能富集在卵巢早衰動物卵巢的卵泡周圍，非閉鎖始基卵泡數(shù)量顯著提高，表明UCMSCs具有向生殖細(xì)胞分化的能力。朱少芳等［32］通過鼠尾靜脈移植人UCMSCs到卵巢早衰的大鼠模型，發(fā)現(xiàn)體外標(biāo)記PKH26的人UCMSCs可遷移至卵巢，主要沿基質(zhì)血管分布，為追蹤人UCMSCs移植后在體內(nèi)生長、分化和轉(zhuǎn)歸提供依據(jù)。李潔等［33］通過移植人羊水來源干細(xì)胞(AFS)治療大鼠卵巢早衰發(fā)現(xiàn)，AFS能有效地恢復(fù)動物的動情周期，提高體內(nèi)雌激素分泌水平，改善卵巢組織卵巢早衰的狀況，并且分階段移植AFS比一次性移植AFS治療效果更顯著。綜上所述，MSCs移植修復(fù)損傷卵巢組織的機(jī)制可能為:(1)MSCs移植后，在特定的微環(huán)境誘導(dǎo)下可分化為受損組織的細(xì)胞，部分補(bǔ)償或替代其功能;(2)MSCs能分泌多種細(xì)胞因子，例如VEGF，HGF，IGF-I，TGF-β和GM-CSF等，通過旁分泌途徑參與顆粒細(xì)胞生長和凋亡調(diào)節(jié)過程。在體外和體內(nèi)都能抑制靶細(xì)胞凋亡，修復(fù)受損組織細(xì)胞。(3)MSCs分化成卵巢組織細(xì)胞后，可能分泌激素，調(diào)控體內(nèi)激素水平。(4)MSCs中可能還存在有生殖干細(xì)胞，分化發(fā)育成各級卵泡，促進(jìn)損傷卵巢功能的修復(fù)，MSCs可分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)，也有助于損傷卵巢的恢復(fù)。

總結(jié)與展望

近年來卵巢早衰的發(fā)病率逐年增高，在女性因素不孕患者中所占的比例亦有逐年上升的趨勢，是婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域的常見疾病。MSCs作為組織損傷修復(fù)治療的一種新方法，為臨床治療POF提供了新思路。MSCs在體外長期培養(yǎng)的過程中始終保持多向分化的潛能，而且易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增及外源基因?qū)牒捅磉_(dá)，具有強(qiáng)大的遷移能力，分泌的多種細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)免疫、支持造血的特性，免疫原性低，遺傳背景相當(dāng)穩(wěn)定并且不受胚胎干細(xì)胞研究中遇到的倫理問題。MSCs的生物學(xué)特性及臨床應(yīng)用已經(jīng)在多種疾病中得到應(yīng)用，修復(fù)損傷組織可通過各種機(jī)制發(fā)揮作用，如分化、遷移、歸巢、免疫調(diào)節(jié)及營養(yǎng)等。近年來采用骨髓、臍帶和羊水來源MSCs移植治療化療藥物、免疫性卵巢炎、半乳糖和化學(xué)因子誘導(dǎo)的卵巢早衰取得了明顯效果，MSCs直接或靜脈注射后，可遷移、定植于卵巢，并在卵巢存活、生長、可恢復(fù)實驗動物卵巢形態(tài)、大小和正常動情周期，增加卵巢各級卵泡數(shù)，促進(jìn)顆粒細(xì)胞生長，抗顆粒細(xì)胞凋亡，改善卵巢內(nèi)分泌功能，恢復(fù)受孕。利用MSCs移植可能改善卵巢早衰患者臨床癥狀及增加受孕幾率。

綜上，已有臨床前研究顯示，MSCs對卵巢早衰具有一定治療作用，但缺乏系統(tǒng)、完善的大樣本臨床前研究證實其安全性和有效性，而且目前國內(nèi)研究局限于初步的動物實驗。各種MSCs抑制顆粒細(xì)胞凋亡和干細(xì)胞在動物體內(nèi)遷移分布等方面的機(jī)制尚需進(jìn)一步完善;MSCs向生殖細(xì)胞分化的潛能、細(xì)胞最佳移植方式、移植部位與數(shù)量、移植時間窗、移植后干細(xì)胞在體內(nèi)的歸巢、轉(zhuǎn)歸及對卵巢損傷修復(fù)的作用評價指標(biāo)等均需要進(jìn)一步的探索研究。MSCs有望徹底治愈POF，也開拓了化療后POF治療的新方向，具有可觀的臨床應(yīng)用前景。（本文作者：李惠敏、李海波、李紅 單位：南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院生殖與遺傳中心）