宮頸癌端粒酶活性與患者診斷預后關系

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【摘要】目的探討宮頸癌人端粒酶RNA(hTERC)擴增和人端粒酶催化單位(hTERT)的表達與患者術后復發(fā)和生存的關系。方法選取2010年6月～2013年6月該院接受手術切除子宮的宮頸癌患者45例為觀察組，因子宮肌瘤行子宮切除的正常宮頸組織患者45例為對照組。采用熒光免疫原位雜交和Westernblot檢測兩組hTERC擴增和hTERT蛋白質水平變化，并根據(jù)hTERC擴增情況比較陰性和陽性患者術后復發(fā)和生存的變化。結果觀察組宮頸癌組織中hTERC擴增陽性率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Westernblot分析顯示，觀察組患者宮頸癌組織中hTERT蛋白質水平較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。hTERT蛋白質陽性患者術后1年、2年和3年累積復發(fā)率明顯高于陰性患者，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，陽性患者術后1年、2年和3年累積生存率明顯低于陰性患者，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論宮頸癌腫瘤組織中端粒酶處于激活狀態(tài)，可作為診斷宮頸癌的輔助指標，同時可能與患者術后預后有關。

【關鍵詞】宮頸癌;端粒酶;術后累積復發(fā)率;累積生存率

近年來提出的端粒酶假說是細胞癌變的早期事件，有望成為宮頸癌早期診斷的輔助標志〔1－2〕。端粒酶活性主要依賴于2個基因的表達，人端粒酶催化單位(hTERT)和人端粒酶RNA(hTERC)。研究顯示〔3－4〕，端粒酶活性在許多腫瘤組織(乳腺癌、肺癌)中處于激活狀態(tài)，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。有研究也顯示〔5〕，端粒酶在宮頸癌腫瘤組織中表達陽性率較高，但對其在患者術后預后方面的報道較少。本研究系統(tǒng)分析端粒酶活性在宮頸癌早期診斷和預后方面的價值。

1資料與方法

1.1資料

選取我院2010年6月～2013年6月收治的因手術切除子宮的宮頸癌患者45例為觀察組，因子宮肌瘤行子宮切除的正常組織患者45例為對照組。觀察組年齡51～69歲，平均年齡(60.4±8.4)歲;對照組年齡50～71歲，平均年齡(61.4±9.4)歲;兩組患者年齡、性別等差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。納入標準:①所有患者均經病理學和陰道鏡檢查進行診斷;②患者術前未接受其他任何形式的治療;③所有患者均簽署知情同意書;④本研究經本院醫(yī)學倫理委員會許可，并監(jiān)督。排除標準:①合并其他腫瘤者;②心、肝和腎功能異常者;③存在感染或免疫功能缺陷者。

1.2材料

雙色位點特異性TERC/CSP3DNA探針購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司;20×SSC雜交緩沖液和胃蛋白酶K購自Sigma公司;封片劑購自碧云天生物科技有限公司;抗人hTERT小鼠單克隆抗體購自Santa公司;熒光原位雜交儀購自CVCytovisionAC.UNK;熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡均購自奧林巴斯公司;FISH分析軟件購自德國LEICA公司;羊抗小鼠二抗購自北京中山金橋生物有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1FISH分析

hTERC擴增制備石蠟組織芯片，并在載玻片上做好標記，石蠟組織芯片56℃烘烤過夜，在二甲苯中脫蠟10min后，依次在100%、95%、70%的無水乙醇中水化5min，然后在蒸餾水中浸泡5min，并在水浴鍋沸水中處理30min修復抗原表位。緊接著在室溫條件下用2×SSC緩沖液漂洗組織芯片2次，每次5min;然后用胃蛋白酶K在37℃消化組織20min，結束后采用2×SSC緩沖液漂洗組織芯片2次，每次5min;用1%甲醛固定10min，再用70%、95%和100%的乙醇逐級脫水2min，56℃加熱玻片，結束后再組織玻片上滴加5～10μl探針混合物，蓋上蓋玻片，用中性樹脂封片。然后設置原位雜交儀，83℃變形5min，42℃雜交16h，結束后用2×SSC緩沖液漂洗組織芯片2次，每次5min;泡掉蓋玻片，置于65℃0.5%NP－40的2×SSC緩沖液漂洗組織芯片2次，每次5min;再用70%的乙醇浸泡3min，自然干燥玻片。然后再用DAPI染色細胞核3min，避光處理10min，然后在熒光顯微鏡下觀察結果。觀察FISH結果，首先在低倍鏡下找到細胞區(qū)域，然后在40×物鏡下觀察標本的治療，最后在100×物鏡下觀察宮頸細胞的FISH結果。顯微鏡下GLPTERC標記為紅色，CSP3標記為綠色。正常細胞可觀察到細胞分裂間期細胞核中紅色和綠色信號各有2個，而異常細胞可觀察到紅色信號大于2個，綠色信號不小于2個。

1.3.2閾值建立

以正常宮頸細胞建立組織細胞芯片，按照上述方法制備關于TERC基因的FISH實驗，然后分析100個細胞，統(tǒng)計TERC、C－myc基因異常擴增的細胞比例。閾值計算=平均數(shù)+3×標準差。若觀察組患者異常數(shù)目大于閾值則認為是hTERC擴增呈陽性，若異常數(shù)目低于閾值則認為是hTERC擴增呈陰性。

1.3.3Westernblot分析

hTERT表達水平取0.1g宮頸癌組織或正常宮頸組織，加入400μl組織裂解液，采用組織勻漿儀勻漿后，置于冰上靜置30min后，12000r/min離心15min，上清部分加入5×Load-ingbuffer，在沸水中煮沸15min后，進行SDS－PAGE，電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉30min后，用抗人hTERT小鼠單克隆抗體(1∶1000)4℃包被過夜，次日，用PBST洗滌3次，每次5min，再用HRP標記的羊抗小鼠二抗室溫孵育1h，結束后用PBST洗滌3次，每次5min;在PVDF膜上涂上發(fā)光液，在暗室進行顯影。以GAPDH作為內參。分析hTERT蛋白的相對表達水平。

1.3.4隨防情況

觀察組患者術后第1年每3個月來我院檢查1次，第2年每半年檢查1次。電話隨訪患者生存情況，隨訪10～36個月，平均隨訪(21.4±8.9)個月。

1.4統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)采用(x±s)表示，計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，累積復發(fā)率和累計生存率比較采用Kaplan－Meier和Log－Rank進行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1兩組宮頸組織hTERC擴增情況采用FISH分析hTERC擴增情況，對照組hTERC擴增5例，陽性率11.11%，觀察組hTERC擴增32例，陽性率為71.11%，觀察組患者宮頸癌組織中hTERC擴增陽性率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2兩組宮頸組織hTRET表達情況對兩組宮頸組織中hTERT蛋白的表達水平進行Westernblot分析，觀察組患者宮頸癌組織中hTERT蛋白的表達水平明顯高于對照組宮頸組織，差異有統(tǒng)計學意義

2.3hTERC擴增與患者術后復發(fā)和生存的關系對觀察組hTERC擴增陽性和陰性患者進行跟蹤隨訪，對其宮頸癌術后復發(fā)和術后生存率進行比較分析，hTERC擴增陽性患者術后1年、2年和3年的累積復發(fā)率分別為12.5%(4/32)，21.88%(7/32)和43.75%(14/32)，hTERC擴增陰性患者術后1年、2年和3年的累積復發(fā)率分別為7.69%(1/13)，15.38%(2/13)和15.38%(2/13)。hTERC擴增陽性患者術后累計復發(fā)率明顯高于陰性患者，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2A。hTERC擴增陽性患者術后1年、2年和3年的累積生存率分別為84.38%(27/32)，65.63%(21/32)和46.88%(15/32)，hTERC擴增陰性患者術后1年、2年和3年的累積生存率分別為92.31%(12/13)，84.62%(11/13)和69.23%(9/13)。hTERC擴增陽性患者術后累計生存率明顯低于陰性患者(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。

3討論

全世界每年將近50萬宮頸癌新發(fā)病例，中國每年約有13.5萬新發(fā)病例，死亡率位居女性腫瘤第2位，嚴重威脅女性健康〔6〕。目前，臨床上用于診斷宮頸癌的手段較單一，存在缺陷〔7〕。端粒酶在許多腫瘤組織中活性異常，可能與腫瘤的發(fā)生和進展相關〔8〕。端粒是真核細胞染色體上一點重復的基因序列，他的主要功能是維持染色體的穩(wěn)定性和完整性，避免其發(fā)生融合、降解或重組等變化。其隨著細胞分裂逐漸變短，減小到一定閾值細胞會自動衰老死亡〔5〕。當端粒酶活性異?；钴S和人端粒酶RNA擴增異常時，可導致細胞一直處于分裂增殖狀態(tài)，最終導致細胞異常增生，導致腫瘤發(fā)生〔9〕。目前，端粒酶在宮頸癌組織中的活性及表達情況是基礎臨床研究的熱點。本研究采用FISH技術和Westernblot分析對宮頸癌組織中hTERC擴增和hTERT蛋白的表達情況進行分析。結果顯示，在宮頸癌組織中hTERC擴增明顯增加，高于對照組;hTERT蛋白在宮頸癌組織中表達水平明顯高于正常宮頸組織，提示，宮頸癌組織中端粒處于異?；钴S的狀態(tài)，可能成為導致宮頸癌發(fā)生的主要原因之一，同時提示，通過檢測宮頸組織中端粒酶的活性可以作為宮頸癌分子診斷的主要方法。手術治療宮頸癌仍然會出現(xiàn)一部分復發(fā)，降低了患者術后生存期〔10〕。將hTERC擴增陽性和陰性患者進行分析隨訪，發(fā)現(xiàn)hTERC擴增陽性患者術后累積復發(fā)率明顯高于陰性患者，術后累積生存率明顯低于陰性患者，提示，hTERC擴增情況可能與患者術后預后存在密切關系，可作為臨床宮頸癌術后預后診斷的一個輔助標志。值得注意的是，本研究樣本數(shù)量較少，有望通過增加樣本數(shù)量進一步探討hTERC擴增和預后的相關性。宮頸癌組織中hTERC擴增異常，且hTERT蛋白處于高表達狀態(tài)，參與了宮頸癌的發(fā)生，且hTERC的擴增與患者術后預后密切相關。

4參考文獻

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10RydzewskaL，TierneyJ，ValeCL，etal．Neoadjuvantche-motherapyplussurgeryversussurgeryforcervicalcancer〔J〕．CochraneDatabaseSystRev，2012，12:CD007406.

作者：吳衡慧 張菊新 單位：河南省人民醫(yī)院婦產科