宮頸癌端粒酶活性與患者診斷預(yù)后關(guān)系

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【摘要】目的探討宮頸癌人端粒酶RNA(hTERC)擴(kuò)增和人端粒酶催化單位(hTERT)的表達(dá)與患者術(shù)后復(fù)發(fā)和生存的關(guān)系。方法選取2010年6月～2013年6月該院接受手術(shù)切除子宮的宮頸癌患者45例為觀察組，因子宮肌瘤行子宮切除的正常宮頸組織患者45例為對(duì)照組。采用熒光免疫原位雜交和Westernblot檢測(cè)兩組hTERC擴(kuò)增和hTERT蛋白質(zhì)水平變化，并根據(jù)hTERC擴(kuò)增情況比較陰性和陽(yáng)性患者術(shù)后復(fù)發(fā)和生存的變化。結(jié)果觀察組宮頸癌組織中hTERC擴(kuò)增陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Westernblot分析顯示，觀察組患者宮頸癌組織中hTERT蛋白質(zhì)水平較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。hTERT蛋白質(zhì)陽(yáng)性患者術(shù)后1年、2年和3年累積復(fù)發(fā)率明顯高于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，陽(yáng)性患者術(shù)后1年、2年和3年累積生存率明顯低于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論宮頸癌腫瘤組織中端粒酶處于激活狀態(tài)，可作為診斷宮頸癌的輔助指標(biāo)，同時(shí)可能與患者術(shù)后預(yù)后有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】宮頸癌;端粒酶;術(shù)后累積復(fù)發(fā)率;累積生存率

近年來(lái)提出的端粒酶假說(shuō)是細(xì)胞癌變的早期事件，有望成為宮頸癌早期診斷的輔助標(biāo)志〔1－2〕。端粒酶活性主要依賴于2個(gè)基因的表達(dá)，人端粒酶催化單位(hTERT)和人端粒酶RNA(hTERC)。研究顯示〔3－4〕，端粒酶活性在許多腫瘤組織(乳腺癌、肺癌)中處于激活狀態(tài)，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。有研究也顯示〔5〕，端粒酶在宮頸癌腫瘤組織中表達(dá)陽(yáng)性率較高，但對(duì)其在患者術(shù)后預(yù)后方面的報(bào)道較少。本研究系統(tǒng)分析端粒酶活性在宮頸癌早期診斷和預(yù)后方面的價(jià)值。

1資料與方法

1.1資料

選取我院2010年6月～2013年6月收治的因手術(shù)切除子宮的宮頸癌患者45例為觀察組，因子宮肌瘤行子宮切除的正常組織患者45例為對(duì)照組。觀察組年齡51～69歲，平均年齡(60.4±8.4)歲;對(duì)照組年齡50～71歲，平均年齡(61.4±9.4)歲;兩組患者年齡、性別等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn):①所有患者均經(jīng)病理學(xué)和陰道鏡檢查進(jìn)行診斷;②患者術(shù)前未接受其他任何形式的治療;③所有患者均簽署知情同意書;④本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)許可，并監(jiān)督。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他腫瘤者;②心、肝和腎功能異常者;③存在感染或免疫功能缺陷者。

1.2材料

雙色位點(diǎn)特異性TERC/CSP3DNA探針購(gòu)自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司;20×SSC雜交緩沖液和胃蛋白酶K購(gòu)自Sigma公司;封片劑購(gòu)自碧云天生物科技有限公司;抗人hTERT小鼠單克隆抗體購(gòu)自Santa公司;熒光原位雜交儀購(gòu)自CVCytovisionAC.UNK;熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡均購(gòu)自?shī)W林巴斯公司;FISH分析軟件購(gòu)自德國(guó)LEICA公司;羊抗小鼠二抗購(gòu)自北京中山金橋生物有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1FISH分析

hTERC擴(kuò)增制備石蠟組織芯片，并在載玻片上做好標(biāo)記，石蠟組織芯片56℃烘烤過(guò)夜，在二甲苯中脫蠟10min后，依次在100%、95%、70%的無(wú)水乙醇中水化5min，然后在蒸餾水中浸泡5min，并在水浴鍋沸水中處理30min修復(fù)抗原表位。緊接著在室溫條件下用2×SSC緩沖液漂洗組織芯片2次，每次5min;然后用胃蛋白酶K在37℃消化組織20min，結(jié)束后采用2×SSC緩沖液漂洗組織芯片2次，每次5min;用1%甲醛固定10min，再用70%、95%和100%的乙醇逐級(jí)脫水2min，56℃加熱玻片，結(jié)束后再組織玻片上滴加5～10μl探針混合物，蓋上蓋玻片，用中性樹(shù)脂封片。然后設(shè)置原位雜交儀，83℃變形5min，42℃雜交16h，結(jié)束后用2×SSC緩沖液漂洗組織芯片2次，每次5min;泡掉蓋玻片，置于65℃0.5%NP－40的2×SSC緩沖液漂洗組織芯片2次，每次5min;再用70%的乙醇浸泡3min，自然干燥玻片。然后再用DAPI染色細(xì)胞核3min，避光處理10min，然后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。觀察FISH結(jié)果，首先在低倍鏡下找到細(xì)胞區(qū)域，然后在40×物鏡下觀察標(biāo)本的治療，最后在100×物鏡下觀察宮頸細(xì)胞的FISH結(jié)果。顯微鏡下GLPTERC標(biāo)記為紅色，CSP3標(biāo)記為綠色。正常細(xì)胞可觀察到細(xì)胞分裂間期細(xì)胞核中紅色和綠色信號(hào)各有2個(gè)，而異常細(xì)胞可觀察到紅色信號(hào)大于2個(gè)，綠色信號(hào)不小于2個(gè)。

1.3.2閾值建立

以正常宮頸細(xì)胞建立組織細(xì)胞芯片，按照上述方法制備關(guān)于TERC基因的FISH實(shí)驗(yàn)，然后分析100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)TERC、C－myc基因異常擴(kuò)增的細(xì)胞比例。閾值計(jì)算=平均數(shù)+3×標(biāo)準(zhǔn)差。若觀察組患者異常數(shù)目大于閾值則認(rèn)為是hTERC擴(kuò)增呈陽(yáng)性，若異常數(shù)目低于閾值則認(rèn)為是hTERC擴(kuò)增呈陰性。

1.3.3Westernblot分析

hTERT表達(dá)水平取0.1g宮頸癌組織或正常宮頸組織，加入400μl組織裂解液，采用組織勻漿儀勻漿后，置于冰上靜置30min后，12000r/min離心15min，上清部分加入5×Load-ingbuffer，在沸水中煮沸15min后，進(jìn)行SDS－PAGE，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉30min后，用抗人hTERT小鼠單克隆抗體(1∶1000)4℃包被過(guò)夜，次日，用PBST洗滌3次，每次5min，再用HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗室溫孵育1h，結(jié)束后用PBST洗滌3次，每次5min;在PVDF膜上涂上發(fā)光液，在暗室進(jìn)行顯影。以GAPDH作為內(nèi)參。分析hTERT蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.4隨防情況

觀察組患者術(shù)后第1年每3個(gè)月來(lái)我院檢查1次，第2年每半年檢查1次。電話隨訪患者生存情況，隨訪10～36個(gè)月，平均隨訪(21.4±8.9)個(gè)月。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用(x±s)表示，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，累積復(fù)發(fā)率和累計(jì)生存率比較采用Kaplan－Meier和Log－Rank進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組宮頸組織hTERC擴(kuò)增情況采用FISH分析hTERC擴(kuò)增情況，對(duì)照組hTERC擴(kuò)增5例，陽(yáng)性率11.11%，觀察組hTERC擴(kuò)增32例，陽(yáng)性率為71.11%，觀察組患者宮頸癌組織中hTERC擴(kuò)增陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2兩組宮頸組織hTRET表達(dá)情況對(duì)兩組宮頸組織中hTERT蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行Westernblot分析，觀察組患者宮頸癌組織中hTERT蛋白的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組宮頸組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.3hTERC擴(kuò)增與患者術(shù)后復(fù)發(fā)和生存的關(guān)系對(duì)觀察組hTERC擴(kuò)增陽(yáng)性和陰性患者進(jìn)行跟蹤隨訪，對(duì)其宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)和術(shù)后生存率進(jìn)行比較分析，hTERC擴(kuò)增陽(yáng)性患者術(shù)后1年、2年和3年的累積復(fù)發(fā)率分別為12.5%(4/32)，21.88%(7/32)和43.75%(14/32)，hTERC擴(kuò)增陰性患者術(shù)后1年、2年和3年的累積復(fù)發(fā)率分別為7.69%(1/13)，15.38%(2/13)和15.38%(2/13)。hTERC擴(kuò)增陽(yáng)性患者術(shù)后累計(jì)復(fù)發(fā)率明顯高于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖2A。hTERC擴(kuò)增陽(yáng)性患者術(shù)后1年、2年和3年的累積生存率分別為84.38%(27/32)，65.63%(21/32)和46.88%(15/32)，hTERC擴(kuò)增陰性患者術(shù)后1年、2年和3年的累積生存率分別為92.31%(12/13)，84.62%(11/13)和69.23%(9/13)。hTERC擴(kuò)增陽(yáng)性患者術(shù)后累計(jì)生存率明顯低于陰性患者(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

全世界每年將近50萬(wàn)宮頸癌新發(fā)病例，中國(guó)每年約有13.5萬(wàn)新發(fā)病例，死亡率位居女性腫瘤第2位，嚴(yán)重威脅女性健康〔6〕。目前，臨床上用于診斷宮頸癌的手段較單一，存在缺陷〔7〕。端粒酶在許多腫瘤組織中活性異常，可能與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)〔8〕。端粒是真核細(xì)胞染色體上一點(diǎn)重復(fù)的基因序列，他的主要功能是維持染色體的穩(wěn)定性和完整性，避免其發(fā)生融合、降解或重組等變化。其隨著細(xì)胞分裂逐漸變短，減小到一定閾值細(xì)胞會(huì)自動(dòng)衰老死亡〔5〕。當(dāng)端粒酶活性異常活躍和人端粒酶RNA擴(kuò)增異常時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞一直處于分裂增殖狀態(tài)，最終導(dǎo)致細(xì)胞異常增生，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生〔9〕。目前，端粒酶在宮頸癌組織中的活性及表達(dá)情況是基礎(chǔ)臨床研究的熱點(diǎn)。本研究采用FISH技術(shù)和Westernblot分析對(duì)宮頸癌組織中hTERC擴(kuò)增和hTERT蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在宮頸癌組織中hTERC擴(kuò)增明顯增加，高于對(duì)照組;hTERT蛋白在宮頸癌組織中表達(dá)水平明顯高于正常宮頸組織，提示，宮頸癌組織中端粒處于異?；钴S的狀態(tài)，可能成為導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要原因之一，同時(shí)提示，通過(guò)檢測(cè)宮頸組織中端粒酶的活性可以作為宮頸癌分子診斷的主要方法。手術(shù)治療宮頸癌仍然會(huì)出現(xiàn)一部分復(fù)發(fā)，降低了患者術(shù)后生存期〔10〕。將hTERC擴(kuò)增陽(yáng)性和陰性患者進(jìn)行分析隨訪，發(fā)現(xiàn)hTERC擴(kuò)增陽(yáng)性患者術(shù)后累積復(fù)發(fā)率明顯高于陰性患者，術(shù)后累積生存率明顯低于陰性患者，提示，hTERC擴(kuò)增情況可能與患者術(shù)后預(yù)后存在密切關(guān)系，可作為臨床宮頸癌術(shù)后預(yù)后診斷的一個(gè)輔助標(biāo)志。值得注意的是，本研究樣本數(shù)量較少，有望通過(guò)增加樣本數(shù)量進(jìn)一步探討hTERC擴(kuò)增和預(yù)后的相關(guān)性。宮頸癌組織中hTERC擴(kuò)增異常，且hTERT蛋白處于高表達(dá)狀態(tài)，參與了宮頸癌的發(fā)生，且hTERC的擴(kuò)增與患者術(shù)后預(yù)后密切相關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

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10RydzewskaL，TierneyJ，ValeCL，etal．Neoadjuvantche-motherapyplussurgeryversussurgeryforcervicalcancer〔J〕．CochraneDatabaseSystRev，2012，12:CD007406.

作者：吳衡慧 張菊新 單位：河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科