植物線蟲病害防治研究
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幾丁質(zhì)是一種由N－乙酰－D－氨基葡萄糖以β－1，4鍵連接而成的多聚糖，是僅次于纖維素的第二大多糖類資源，也是甲殼類動物以及許多昆蟲、真菌、線蟲等病原物體壁結(jié)構的重要組成部分。幾丁質(zhì)酶是具有生物催化活性的水解酶，化學名稱為（1，4）－β－乙?；璑－聚葡糖胺酶，能特異性地將幾丁質(zhì)水解為寡聚糖和N－乙酰氨基葡萄糖，其水解產(chǎn)物具有抗菌、抗腫瘤等生物活性，在食品，藥物以及植物病害防治等領域具有廣泛的應用前景。幾丁質(zhì)酶廣泛存在于自然界中的動物、植物、微生物等體內(nèi)，是一類具有重要作用的酶類。許多微生物包括幾乎所有的昆蟲及線蟲病原細菌、真菌均可產(chǎn)生胞內(nèi)或胞外幾丁質(zhì)酶，在有害昆蟲及線蟲等的生物防治中發(fā)揮著重要的作用，因而引起人們越來越多的關注。本文對微生物幾丁質(zhì)酶研究概況及今后的工作展望進行了綜述。
1微生物幾丁質(zhì)酶的研究現(xiàn)狀
目前，國內(nèi)外的研究主要側(cè)重于不同來源的幾丁質(zhì)酶對不同底物的作用機理、遺傳工程學和生態(tài)學意義等。隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，人們展開了對幾丁質(zhì)酶的分子結(jié)構、同源性等研究，以解釋其抑制真菌生長及殺蟲的分子機理。其中研究較多的有：蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis，Bt），其產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶對探討該酶在Bt殺蟲中的作用、提高殺蟲活性和擴大殺蟲譜的研究具有重要意義；球孢白僵菌（Beauveriabassiana）在以幾丁質(zhì)為基質(zhì)的條件下，可被誘導產(chǎn)生大量胞外幾丁質(zhì)酶，其殺蟲機理是其芽管新梢分泌的幾丁質(zhì)酶能將昆蟲體表的幾丁質(zhì)分解，侵入昆蟲體內(nèi)后菌絲四處穿透并充滿個體腔，最終昆蟲新陳代謝紊亂、死亡呈現(xiàn)白色僵硬狀；哈茨木霉（Trichodermaharzianum）產(chǎn)生的胞外酶中，幾丁質(zhì)酶不僅出現(xiàn)時間早、生物活性高，在重寄生過程中具有重要的作用，可以用于防治植物病原體，而且其在消除甲殼類廢料中具有工業(yè)價值。研究表明木霉G蛋白參與了幾丁質(zhì)酶的形成，并進行了不同抗真菌次生代謝產(chǎn)物分子機制的研究。
幾丁質(zhì)酶能酶解許多病原微生物細胞壁的重要結(jié)構成分幾丁質(zhì)，從而使病原微生物死亡。根據(jù)這一特性，其在植物病害的防治中有著極其廣泛的用途和巨大的潛力。近年來，由于植物寄生線蟲的危害日益嚴重，尋找高效低毒的線蟲生物防治因子越來越引起人們的重視，而幾丁質(zhì)酶由于被證實可有效地作用于線蟲，在線蟲的生防中將發(fā)揮越來越重要的作用。如食線蟲真菌所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶等胞外酶，可作用于線蟲體表角質(zhì)層和卵殼的幾丁質(zhì)層，在侵染線蟲的過程中起到關鍵作用；同時還發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶本身也可作為侵染宿主的毒性因子發(fā)揮作用，它在侵染過程中作為水解酶的其它潛在功能也在研究中。用蠟蚧輪枝胞屬的食線蟲真菌培養(yǎng)濾液所產(chǎn)的幾丁質(zhì)酶處理Globoderapallida線蟲卵，掃描電鏡觀察顯示可破壞卵表面的結(jié)構組成。另外，木霉菌、蠟蚧輪枝菌均可用來防治大豆胞囊線蟲等植物寄生線蟲。先接種AM真菌后再接種SCN的大豆根內(nèi)幾丁質(zhì)酶和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性顯著提高，證明Chibl和PAL5基因表達可能是AM真菌誘導植物抗大豆胞囊線蟲病害防御反應的一種表現(xiàn)，推測這2個基因直接參與了AM真菌誘導大豆抗胞囊線蟲病害的防御反應。曾有報道2001年，在印度的喀拉啦省從香蕉病株的根部發(fā)現(xiàn)的線蟲胞囊中分離出11種真菌，其中包括總狀共頭霉（Syncephalastrumracemosum，Sr．）菌株，這些真菌能夠侵染胞囊線蟲的卵及幼蟲，從而破壞卵的孵化，對香蕉和水稻胞囊線蟲來說，這些真菌具有潛在的生防能力。其侵染過程是否與產(chǎn)幾丁質(zhì)酶有關有待證實。線蟲生防菌株Sr18的代謝產(chǎn)物可以安全高效地防治植物寄生線蟲，在研究其代謝產(chǎn)物殺線蟲活性過程中，發(fā)現(xiàn)有線蟲被消解的現(xiàn)象，這可能與產(chǎn)水解酶如幾丁質(zhì)酶有關。
3微生物幾丁質(zhì)酶在其它植物病害防治中的應用
3．1真菌病害的生物防治
大多數(shù)植物病害是由真菌引起的，產(chǎn)幾丁質(zhì)酶微生物分解真菌細胞壁的多數(shù)植物病原真菌細胞壁的重要成分幾丁質(zhì)。幾丁質(zhì)酶可殺死病原真菌，用于農(nóng)作物的生物防治中。Horikoshi等研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生毒素的黃曲霉菌能被環(huán)狀芽孢桿菌裂解，并且隨著加入的幾丁質(zhì)酶濃度的提高，裂解效率也隨之提高。Mitchell等研究表明，只要能裂解真菌細胞壁的微生物菌株都含有幾丁質(zhì)酶。植物生長促生根際細菌熒光假單胞菌可在不同的基質(zhì)上產(chǎn)胞外幾丁質(zhì)酶，可抑制菌絲生長，被用于抗真菌病害，其抑制真菌生長可能的機制：絲狀真菌的菌絲頂端暴露的幾丁質(zhì)鏈會被幾丁質(zhì)酶所水解，細胞壁變薄，原生質(zhì)膜破裂；同時菌絲末端新合成的幾丁質(zhì)也能被幾丁質(zhì)酶降解，使真菌孢子萌發(fā)，芽管伸長受阻，破壞菌絲端部生長。已有研究發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)酶對真菌孢子萌發(fā)的抑制作用有一定的特異性。哈茨木霉菌被廣泛用于植物病害生物防治中，其可分泌產(chǎn)生細胞降解酶類，其中以幾丁質(zhì)酶尤為重要，幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生在木霉防治病原菌的機制中占重要地位。
3．2在害蟲防治中的增效作用
內(nèi)寄生真菌可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，防治牛豆象甲，包括哈茨木霉可產(chǎn)生水解酶用于害蟲生防。在害蟲防治方面，微生物幾丁質(zhì)酶還具有增效作用。許多昆蟲的中腸具有圍食膜，主要成分是幾丁質(zhì)。圍食膜是昆蟲防止病原細菌或病毒傳染的一道天然屏障，少量的昆蟲病原真菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶可破壞角質(zhì)層及幾丁質(zhì)屏障，利用蠟蚧輪枝菌孢子作為生物防治昆蟲和害蟲的手段受到極大的關注。微生物幾丁質(zhì)酶對蘇云金芽孢桿菌制劑也有增效作用。對有些害蟲，微生物幾丁質(zhì)酶不是水解圍食膜的幾丁質(zhì)，而是提高殺蟲制劑的殺蛋白活性，如果單獨使用微生物幾丁質(zhì)酶無殺蟲效果，因此其可作為殺蟲制劑的增效劑。
3．3在基因工程中的應用
基于幾丁質(zhì)酶的特性，可將其應用于基因工程中。20世紀80年代以來，許多科學家致力于將外源微生物的幾丁質(zhì)酶基因?qū)胫参镆蕴岣咧参锏目共∠x性和生防效果。煙草、馬鈴薯、水稻、番茄、蘋果、葡萄等植物已經(jīng)成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株，表達了幾丁質(zhì)酶生物活性。與對照相比，轉(zhuǎn)基因植物不僅可抗真菌，對線蟲、昆蟲和其它一些病原微生物也有一定的抗性。
4微生物幾丁質(zhì)酶降解產(chǎn)物的應用
許多細胞壁含幾丁質(zhì)的微生物能被微生物幾丁質(zhì)酶分解，可用于真菌原生質(zhì)體的釋放，產(chǎn)生菌體蛋白；幾丁質(zhì)部分水解產(chǎn)生的氨基糖寡糖素，在調(diào)節(jié)動植物細胞生命代謝活動中起著非常重要的作用；幾丁質(zhì)酶的降解產(chǎn)物可用于制藥、食品、化妝品及動物飼料等行業(yè)，特別是對甲殼類水生動物廢棄物的生物轉(zhuǎn)換，對于環(huán)境保護和資源的再利用方面起到非常重要的作用，因此有著廣闊的應用開發(fā)前景。
5展望
對于開發(fā)新的種質(zhì)資源，發(fā)現(xiàn)新的幾丁質(zhì)酶高產(chǎn)菌的報道也開始增多，如從極端環(huán)境分離的熱穩(wěn)定性幾丁質(zhì)酶等；另外，由于海水的特殊環(huán)境，海洋微生物多數(shù)具有產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的能力，因此人們越來越把關注的目光投向產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的海洋微生物的篩選；另外，有關酸性、中性幾丁質(zhì)酶的研究較多，而對堿性幾丁質(zhì)酶的研究較少，而海灘、鹽堿地又是堿性幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的生長場所，因此，今后會有更多的工作要做，通過改善培養(yǎng)條件，尋找合適的發(fā)酵工藝，來提高產(chǎn)酶量?？傊?，微生物幾丁質(zhì)酶作為一種生物活性物質(zhì)，在防治由真菌、昆蟲及線蟲等低等生物引起的植物病蟲害中發(fā)揮著重要的作用。目前，微生物幾丁質(zhì)酶在分子生物學方面的研究不斷深入，已克隆了多種微生物的幾丁質(zhì)酶基因。幾丁質(zhì)酶無論從幾丁質(zhì)資源的開發(fā)利用減輕污染、保護環(huán)境，還是發(fā)揮幾丁質(zhì)原料及幾丁質(zhì)酶系統(tǒng)在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、食品乃至藥物中的作用，都展現(xiàn)出廣闊的良好前景。因此，在未來的農(nóng)業(yè)中，對微生物幾丁質(zhì)酶的結(jié)構修飾、作用機理及轉(zhuǎn)基因研究將會更加深入，其將在人類生產(chǎn)生活中發(fā)揮更大的作用。
作者：侯金麗 單位：河南工業(yè)貿(mào)易職業(yè)學院
