皮革與膠原等電點的測定方式
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本文作者：程海明、陳敏、李志強 單位：四川大學(xué)制革清潔技術(shù)國家工程實驗室
等電點(IsoelectricPoint，PI)是兩性電解質(zhì)的特征物理參數(shù)。兩性電解質(zhì)在電場中不發(fā)生遷移時其溶液或懸浮液所處的pH值為該兩性電解質(zhì)的等電點［1］。此外還有另外一些對等電點的定義，如Michaelis［2］將等電點定義為溶液中兩性電解質(zhì)的正離子與負離子的數(shù)量相等時氫離子的濃度。Sorens-en等［3］對等電點的定義則是溶液中兩性電解質(zhì)的平均價態(tài)為零時的氫離子濃度。這些定義都與電泳時兩性電解質(zhì)的零位移相一致。對于固體材料，如陶瓷或皮革，其表面有不同的極性基團，這類材料的等電點被規(guī)定為當(dāng)物體表面不帶有凈電荷時的pH值［4］。
蛋白質(zhì)是一種典型的聚兩性電解質(zhì)。蛋白質(zhì)肽鏈的兩端有游離的氨基和羧基，側(cè)鏈上更帶有若干酸性基團和堿性基團，這些基團都具有放出或接受質(zhì)子的性質(zhì)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液的pH值達到某一特定值時，蛋白質(zhì)分子不帶凈電荷，此時的pH值即為蛋白質(zhì)的等電點。不同的蛋白質(zhì)由于所帶酸性和堿性基團不等，而等電點不同［5，6］。等電點特性是蛋白質(zhì)極其重要的性質(zhì)，對蛋白的分離、純化和分析等都具有重要的實用價值［7］。
作為動物皮制革的對象，是由膠原蛋白聚集而成的膠原纖維束編織而成，膠原蛋白和由其聚集而成的膠原纖維皆具有一定的等電點。對天然膠原等電點的認(rèn)識經(jīng)歷了較長的一段時間，這是因為在最初的研究過程中所使用的樣品為經(jīng)過堿處理之后的皮粉，現(xiàn)在我們知道天然膠原的等電點在6．5～7．8［8］。制革過程中由于酸、堿、鹽以及鞣劑的作用，天然膠原的等電點會隨著處理條件的不同而發(fā)生不同的改變。如，用堿法制得的明膠其等電點為4．7～5．2，酸法制得的明膠等電點在7～9左右［8］。在浸灰過程中，堿能促使膠原主鏈或支鏈上酰胺鍵水解，產(chǎn)生游離的羧基而氮原子以氨氣的形式揮發(fā)出來，從而導(dǎo)致膠原分子中的羧基數(shù)量相對增大，進而使得膠原和裸皮表面的等電點向低pH值的區(qū)域偏移［9］。膠原蛋白的等電點及其在制革過程中發(fā)生的變化對制革工藝的制定很重要。制革的很多工序的工藝是根據(jù)皮膠原所處的等電點來進行設(shè)計的。
制革操作過程中的特定pH值使得皮膠原帶有正、負或不帶電荷，從而實現(xiàn)皮膠原與相應(yīng)的皮革化學(xué)品發(fā)生反應(yīng)，達到制革的目的。例如，脫灰、軟化后裸皮的pH值約在7．5～8．5之間，而裸皮的等電點在pH值5左右，此時裸皮仍處于堿性狀態(tài)。如果脫灰、軟化后進行鉻鞣，裸皮的pH值顯得高了，鉻鞣劑將在裸皮表面富集，難以滲透至皮纖維內(nèi)部，有產(chǎn)生過鞣的危險。裸皮的浸酸就可以脫去軟化后的裸皮中剩余的堿，以實現(xiàn)裸皮pH值的繼續(xù)下降，保證鉻鞣的需要［10］。
鞣劑與膠原纖維作用前后，皮革的等電點將發(fā)生較大的變化。如浸酸裸皮的等電點為5．5左右，而鉻鞣后皮革的等電點變?yōu)?．0左右，植鞣后皮革的等電點變?yōu)?．2～4．0［11］。鞣劑鞣制后皮革的等電點發(fā)生變化，可能是因為鞣劑與皮膠原分子某些帶電荷的基團發(fā)生了結(jié)合，而使這些基團封閉不能離解。因此，可以根據(jù)等電點的變化情況了解膠原分子上有多少這樣的基團與鞣劑發(fā)生了反應(yīng)，這些基團的性質(zhì)如何等等信息，為揭示制革化學(xué)中關(guān)鍵的鞣制機理問題提供重要線索。
目前關(guān)于皮革及膠原等電點這一基礎(chǔ)數(shù)據(jù)仍較混亂，不同等電點的表征方法所得數(shù)據(jù)相互之間缺乏可比性，下文將對目前表征膠原及皮革等電點的方法進行綜述。
2可溶性膠原及其降解物的等電點表征方法
蛋白質(zhì)的等電點可以通過實驗測定，也可以根據(jù)其氨基酸組成進行理論計算得出?？扇苄阅z原及其降解物等電點的表征方法進行總結(jié)如下。
2．1實驗測定
根據(jù)等電點的定義，可以用電泳方法來直接表征可溶性蛋白的等電點，但大多數(shù)研究的膠原及明膠的等電狀態(tài)是利用其物理性能和化學(xué)活性在等電點時發(fā)生巨大的改變而獲得。如:黏度最小、膨脹度最小、滲透壓最低、電導(dǎo)率最小、濁度最大等。當(dāng)用這些測定的數(shù)據(jù)對pH值作圖，在鄰近或等電點處曲線都有一個劇烈的下降或傾斜。以下對一些常用的測定等電點的方法分別進行介紹。
黏度法［12］:明膠稀溶液的黏度隨溶液pH值改變而發(fā)生變化，是由于明膠分子帶電而使其產(chǎn)生變形的結(jié)果。在等電點附近時，明膠分子為電中性，分子收縮，所以黏度最低;當(dāng)偏離等電點使pH升高或降低時，黏度都增加，這是由于明膠分子的凈電荷隨pH變化而增加，靜電排斥力使得明膠分子鏈展開的緣故。例如配制一定濃度的明膠溶液，在不同pH值條件下用毛細管黏度計，通常為奧氏黏度計測定其相對黏度，將所得的各pH值條件下的相對黏度對pH作圖，找到最低相對黏度時的pH值，此pH值即為明膠的等電點。乙醇
沉淀法［13］:明膠易溶于水，即使處于等電點附近仍能溶解成為均勻的明膠水溶液，但當(dāng)加入沉淀劑無水乙醇時，即產(chǎn)生明顯易見的白色沉淀。乙醇沉淀法的原理是明膠溶液產(chǎn)生白色沉淀所需的無水乙醇耗用量，在處于等電點時出現(xiàn)極小值，以此來確定明膠的等電點。不同pH值的明膠溶液各取5mL置于比色管中，加水5mL，搖勻，向試樣溶液中逐滴加入無水乙醇直至出現(xiàn)可見的白色沉液為止。記錄膠液的pH與所耗用的無水乙醇毫升數(shù)，繪制乙醇消耗毫升數(shù)－pH值關(guān)系曲線，取最低點對應(yīng)的pH值即為明膠等電點。
乳光法［13］:在較低溫度時，溶液濃度不低于0．5%的情況下，若介質(zhì)pH在等電點附近，明膠大分子會發(fā)生暫時的絮凝。這是因為，等電點時明膠大分子中正、負離子數(shù)相等，分子鏈構(gòu)象呈最卷曲狀態(tài)，形成具有定向排列的復(fù)合膠團點陣，通過膠團表面間的側(cè)基及氫鍵相互連接、聚集，而處于準(zhǔn)絮凝狀態(tài)．當(dāng)光線入射時出現(xiàn)乳白色散射光。配制一組濃度相同而pH范圍在3～7之間，相鄰兩試樣的pH差為0．2～0．3的明膠溶液，等體積吸取各試樣溶液于比色管中，放于冰水浴中冷卻使其凝凍，取乳白光最強者的pH值為試樣的等電點。
滴定法:劉白玲等［14］將酶法提取的豬皮膠原重新溶解在0．5mol/L的醋酸中，得澄清溶液，以6mol/LNaOH滴定，直至膠原溶液出現(xiàn)沉淀，且沉淀不再溶解，測定此時的pH，重復(fù)測定3次，取平均值，即為該膠原的等電點。用該方法測得胃蛋白酶提取的豬皮膠原其等電點為4．98。王碧等［15］配制一定濃度的不同膠原蛋白及多肽溶液，分別用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，繪制電位滴定曲線，并做一次微商曲線，確定各膠原蛋白及多肽溶液的滴定終點。進而確定氨基(NH2－)和羧基(－COOH)的表觀平衡常數(shù)K1和K2，據(jù)此求得各樣品的等電點pI=(pKl+pK2)/2。
熒光法［16］:有實驗表明，在一定的pH值范圍內(nèi)，明膠的熒光強度與其黏度之間應(yīng)呈現(xiàn)相反的變化趨勢，所以測出不同pH值下一定濃度的明膠溶液的熒光強度，并測出對應(yīng)的黏度值，熒光強度最大處和黏度最小處應(yīng)對應(yīng)于同一pH值，此pH值即為該明膠的等電點。
等電聚焦法［17］:等電聚焦(IEF)是一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離分析技術(shù)，它是利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電點的不同，在一個穩(wěn)定連續(xù)的、線性pH梯度中進行蛋白質(zhì)的分離。氨基酸側(cè)鏈在不同的pH環(huán)境中所帶電荷不同，在蛋白質(zhì)處于等電點時，它的凈電荷為零，在電場中也就停止了泳動。因此可通過測定其凈電荷為零時所處的環(huán)境pH值而測定出該蛋白的等電點。等電聚焦的實施方法可以是園盤電泳，平板電泳以及毛細管電泳，其關(guān)鍵點是需要在凝膠中形成連續(xù)穩(wěn)定的線性pH梯度，這需要在凝膠中添加一定的載體兩性電解質(zhì)實現(xiàn)。
其它鞣劑鞣制研究方面，郭文宇等［18］使用等電聚焦法測定了不同鞣劑鞣制明膠溶液的等電點。各鞣劑對明膠處理后等電點的變化可以看出，膦鹽鞣制體系不同于鉻鞣以及單獨的醛鞣體系。采用膦鹽鞣制后皮膠原的等電點先下降后升高，而甲醛作用后明膠的等電點隨著甲醛的用量的增大而逐漸降低，鉻鞣過后明膠的等電點逐漸升高至6．5左右。
從等電點的定義出發(fā)，可知采用等電聚焦法進行等電點的測定，所得結(jié)果精確性較高，但等電聚焦方法過程復(fù)雜，需要標(biāo)準(zhǔn)的pI兩性電解質(zhì)，實驗過程中需要防止對流擴散，而且對樣品有一些特殊要求。其它實驗方法實施起來相對簡單，但存在誤差較大的問題。由于蛋白質(zhì)各種物理性質(zhì)的不同，使得不同方法測定的等電點在數(shù)值上存在差異，可能也是膠原等電點這一基本數(shù)據(jù)一直以來眾說紛紜的根源所在。
2．2理論計算
蛋白質(zhì)都具有特定的氨基酸組成和排列?？疾斓鞍踪|(zhì)等電點可以根據(jù)其氨基酸組成，將堿性氨基酸和酸性氨基酸殘基的pKb和pKa值分別找出，然后進行理論計算，可以得到該蛋白質(zhì)的理論等電點。將理論計算得出的等電點與實驗測定得數(shù)值進行比較可以揭示蛋白質(zhì)分子間的相互作用和構(gòu)象特征等信息［19］。最近有很多這一方面的文獻報到［19－23］。蛋白質(zhì)等電點理論計算的理論基礎(chǔ)是計算pH梯度的Henderson-Hasselbalch方程［20］。pH=pKa+log(［A－］/［HA］)(1)蛋白質(zhì)處在等電點時，其分子中帶正電荷的基團總數(shù)與帶負電荷的基團總數(shù)相等，方程可以表示為:ΣiAi/［1+10(pKAi–pI)］=ΣiBi/［1+10(pI–pKBi)］(2)等式的左邊為酸性基團的加和，右邊為堿性基團的加和。
組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中，其中有7種是酸性或堿性氨基酸，再加上蛋白質(zhì)兩端未參與成鍵的氨基和羧基，使得需要用9個電離常數(shù)來描述蛋白質(zhì)氫離子的電離平衡。即便這9個電離常數(shù)不受介質(zhì)環(huán)境的影響，計算過程也已相當(dāng)復(fù)雜，從而有了各種近似和模擬計算方法［20－23］。
根據(jù)其中主要的酸性基團和堿性基團，離解常數(shù)可減少到2個即一個酸性離解常數(shù)，一個堿性離解常數(shù)。簡化之后就可以推導(dǎo)出等電點與這兩個離解常數(shù)以及酸性基團和堿性基團摩爾比之間的表達式。Sillero等［20－21］采用擺動方法(oscillatingmethod)，Patrick-ios和Yamasaki［23］利用非線性回歸方法，對多肽和蛋白質(zhì)等電點的計算進行簡化。他們根據(jù)蛋白質(zhì)酸性基團與堿性基團的比例，分成三種情況，一種是酸性基團遠遠多于堿性基團(R1)，一種是堿性基團遠遠多于酸性基團(R1)，還有一種即為兩者數(shù)量相近(R→1)。pI=pKa－logR當(dāng)R1時;pI=pKb－logR當(dāng)R1時;pI=(pKa+pKb)/2+10［(pKb–pKa)/2］×(1－R)/(2ln10)當(dāng)R→1時;(3)對這些數(shù)值進行非線性回歸分析。通過對58種已知氨基酸組成的蛋白質(zhì)的等電點的計算，發(fā)現(xiàn)當(dāng)取pKa=4．9、pKb=10．0時，所得等電點的值與電泳方法測定的值其平均絕對偏差為0．7個pH單位，這一結(jié)果與采用不簡化方程的計算結(jié)果相當(dāng)吻合。根據(jù)氨基酸組成來進行理論預(yù)測蛋白質(zhì)的等電點沒有普遍適用的方法，因為等電點與氨基酸組成之間的關(guān)系復(fù)雜，帶電基團在微環(huán)境中電離行為也有很大影響。各電離常數(shù)的值對蛋白所處微環(huán)境的依賴性使得問題相當(dāng)復(fù)雜。這些微環(huán)境的影響由相鄰或較遠的氨基酸殘基間存在的分子內(nèi)靜電引力和疏水作用力導(dǎo)致。對這些作用力進行估算的困難被加重除了與蛋白質(zhì)肽鏈氨基酸殘基序列有關(guān)而外，還與氨基酸殘基在三維空間內(nèi)的折疊蛋白質(zhì)構(gòu)象的相對位置有關(guān)。
膠原蛋白由于其特征的三螺旋結(jié)構(gòu)，筆者認(rèn)為要對膠原及其降解物等電點進行相對精確的理論預(yù)測，需要考慮膠原特殊的空間螺旋結(jié)構(gòu)對各基團電離常數(shù)的影響。
3不溶于水的膠原纖維、皮及皮革等電點表征方法
以上等電點的實驗測定方法均要求所測試樣在水中能夠溶解，對難溶于水的一類蛋白及其他兩性物質(zhì)的等電點的測定，實施起來難度就大得多。天然膠原蛋白在水中的溶解性能很差，從動物組織制得的固相膠原纖維要再次溶于水中，溶解度更低。制革過程中的裸皮及半成品均是不溶于水的塊狀固體，為了制革工藝的科學(xué)設(shè)計和順利實施，需要測定這些處于固態(tài)的裸皮或半成品的等電點。
前人對皮革等電點的表征采用的方法有染色法、滴定曲線法以及等電聚焦法等［1］。對于不溶于水的膠原纖維而言，采用等電聚焦法實施起來有一定的困難，需要以懸浮液來進行電泳，并要求電泳過程中懸浮液中的顆粒不沉降。
Kelly將染料染色方法引入來測定膠原的等電點［24］。該方法的原理是，膠原在偏酸性時與酸性染料結(jié)合，而堿性染料與膠原具有親和力僅在偏堿性條件下。如當(dāng)皮粉(浸灰、脫灰處理膠原)的pH值低于5時，發(fā)現(xiàn)黃色的酸性染料與其結(jié)合，當(dāng)皮粉的pH值高于5時，紅色的堿性染料與其結(jié)合。所以得出皮粉的等電點為5。用于這一方法的染料需要選擇相對簡單的化合物，與皮膠原只用染料分子中簡單的離子基團相結(jié)合。而對較復(fù)雜組分的染料，含有配位活性的基團，離子反應(yīng)不具備相對的選擇性。
Staverman用測量電解電動勢來表征由豆蛋白、壓緊的皮粉所制成的膜的等電點，或剖層皮的等電點［8］。在原電池中，剖層皮作為膜，將濃度分別為0．1mol/L和0．01mol/L兩種濃度的KCl溶液隔開，用甘汞電極測量兩個半電池的電勢差。為表征膜的等電點，原電池中注滿已知pH值的適量的緩沖溶液，使緩沖體系的pH值在該膜的等電點附近，以電勢差對pH作圖，曲線在X軸上的交點即為其等電點。
在鉻鞣機理的研究過程當(dāng)中，用染色技術(shù)測定膠原分別經(jīng)陽離子鉻配合物和陰離子鉻配合物作用后等電點的變化［25］。結(jié)果顯示，鉻鞣前的皮粉的等電點在pH值5．5處，經(jīng)陽離子鉻配合物鞣制后等電點升高到6．5～7．5，經(jīng)陰離子鉻配合物鞣制后等電點降低到4．0～4．5。這一結(jié)果揭示陽離子鉻配合物主要與膠原的酸性基團反應(yīng)，而陰離子鉻配合物與膠原的堿性基團反應(yīng)。充分研究陽離子和陰離子鉻配合物與膠原等電點的關(guān)系之后，結(jié)果指出陽離子鉻配合物降低了膠原陰離子基團的活性，主要是膠原上的羧基與其反應(yīng);膠原的陽離子基團與陰離子鉻配合物反應(yīng)而使其活性降低。
4展望
至今，可溶性膠原及其降解物等電點的精確測量仍是以等電聚焦電泳方法最佳，如何改進等電聚焦電泳方法的精確性是一個發(fā)展方向。毛細管等電聚焦［26］、固相pH梯度等電聚焦［27］等對提高等電聚焦方法的精確性至關(guān)重要。固相pH梯度等電聚焦比傳統(tǒng)的等電聚焦具有更高的分辨率，其分辨率可達0．001pH。
對膠體溶液中粒子的等電點，有人通過測定其zeta電位的變化來表征［28］，在zeta電位為零時膠體溶液的pH值，即為膠質(zhì)的等電點，而膠原蛋白溶液即是典型的膠體溶液，從而可以用此方法來表征膠原蛋白的等電點。程海明等［29］用zeta點位滴定法對膠原及明膠溶液的等電點進行了測定，當(dāng)zeta點位值為0時的pH為膠原的等電點，并將該方法與等點聚焦法進行了比較。結(jié)果表明，用zeta電位滴定法所得膠原等電點值在7．5左右，該值與等電聚焦法所得結(jié)果非常接近。另外對金屬氧化物膜表面的等電點，有人采用了測定其不同pH值條件下的接觸角來表征［30］，其原理是當(dāng)該膜處在等電點的pH值時，其接觸角最大。通過測定不同pH值條件下的接觸角，找到最大值時的pH值，即為該金屬氧化物表面的等電點。此方法有望作為皮革或其他兩性織物表面等電點的測定方法。
總之，對膠原及皮革等電點的表征方法仍然需要進行深入的研究，以獲得更為精確的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。膠原及皮革等電點的研究對制革工藝的制定有重要的指導(dǎo)意義;此外，也對了解膠原分子與鞣劑的相互作用有重要作用，對揭示各種鞣劑的鞣革機理有一定的貢獻。
