核酸檢測方法精選(九篇)
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第1篇：核酸檢測方法范文
作者簡介：馮曄晨(1974－)，男(漢族)，浙江寧波人，工程師，主要從事建筑結(jié)構(gòu)設(shè)計工作。
摘要：當僅需要了解框架結(jié)構(gòu)的側(cè)移時，可采用一種高層框架側(cè)移簡化計算方法－合并梁法。本文以4跨22層框架為例，分別采用兩種不同等效框架簡化計算，結(jié)果表明：簡化計算框架結(jié)構(gòu)側(cè)移是可行的，且簡化程度對計算精度影響不大，該法可為框架結(jié)構(gòu)側(cè)移的快速估算提供參考。
關(guān)鍵詞：框架；簡化方法；合并梁
中圖分類號：TU311．4
文獻標識碼：B
文章編號：1008－0422(2007)02－0070－03
1 引言
水平荷載作用下，框架側(cè)移的計算有三種手算方法：反彎點法、D值法。前者計算較為簡單，但計算精度不夠：后者較為精確，當工作量較大，碰到層數(shù)較多的高層框架結(jié)構(gòu)時，計算工作量更大。初步設(shè)計階段，往往需要工程設(shè)計人員能對結(jié)構(gòu)的受力性能不僅有個定性的把握，最好能對一些受力指標有個定量的估算。因此，當僅需要了解框架結(jié)構(gòu)的側(cè)移時，可采用一種高層框架側(cè)移簡化計算方法一合并梁法。所謂合并梁法就是根據(jù)位移相同的原則，將若干小層梁合并為一大層，得到相應(yīng)部位的等效梁柱的慣性距，得到較為簡單的等效框架，能夠大幅度減少計算的工作量。
2 合并梁法
2．1框架側(cè)移計算
Smith＆Coull認為，水平荷載作用下的框架層間側(cè)移由三部分組成：第一部分是由于梁的雙曲率彎曲變形引起的節(jié)點轉(zhuǎn)動產(chǎn)生的側(cè)移δb；第二部分是由柱的雙曲率彎曲變形引起的側(cè)移δc；第三部分是由于柱子軸向變形使結(jié)構(gòu)整體彎曲而引起的側(cè)移δN，即層間總側(cè)移δ=δc+δb+δN，當框架高寬比小于4時，可忽略最后一項，即δ=δc+δb。
除底層外的其余各層，假定反彎點在柱高的一半及梁的跨中，梁彎曲變形引起的層間位移
柱彎曲變形引起的層間位移
式中，Vi為第層的總剪力；E為混凝土彈性模量；lb、lc分別為框架梁、柱截面慣性距；l為框架梁、柱的跨度、hi，為第i層層高。
2．2合并梁計算
當各樓層相同時，可以將各層梁依次合并起來形成一個層數(shù)較少的模型。為表述方便，以圖1框架結(jié)構(gòu)為例，有三根各由三根梁合并成的單梁，首層和頂層梁不能合并，因為在頂部和基底附近框架的受力性能明顯地與中間部分不同。在圖1(b)中，第二層和頂層下面一層的梁保持原樣，以便能夠更接近于真實的邊界條件。
對等效合并梁框架的要求是在水平荷載作用下節(jié)點的平移與原始結(jié)構(gòu)相同。對于梁受彎引起的平移，式(1)表明只要每根等效梁的慣性矩等于原框架被合并的n根梁的慣性矩之和，該條件即能滿足，即
等效合并梁框架的柱子特征值的確定可參考式(2)。對等效框架層高為nh處的層間柱由于雙率彎曲引起的位移分量應(yīng)等于原始框架中n層的相應(yīng)水平位移。
根據(jù)上式可得出等效柱的慣性矩為
在圖1(a)所示的結(jié)構(gòu)中，三根等高柱Ic8,Ic9及c10可以由等效合并梁模型中一個三層高的等效柱取代，該等效的慣性矩為
在梁被合并的各區(qū)段內(nèi)如果相繼每層柱的慣性矩都相同。那么高度為3h的等效柱慣性矩將是原來單層柱的9倍(圖1)，如果高度為2h的中間區(qū)段其等效柱的慣性矩為原來單層柱的4倍。
3 算例
某22層高層框架(如圖2所示)，底層層高5．0m：其余層層高3．2m?；炷翉姸菴40。截面尺寸如下：框架柱b×h=0．8m×0．8m；框架梁：b×h=0．25m×0．6m。
將原框架結(jié)構(gòu)(圖1－a)簡化等效框架1(圖1－b)和等效框架2(圖1－c)，以便探討簡化程度對計算精度的影響。
①等效框架1
等效梁慣性矩(3根小梁合為1根大梁)
等效柱慣性矩(3根短柱合為1根長柱)
②等效框架2
等效梁慣性矩(9根小梁合為1根大梁)
等效柱慣性矩(5根短柱合為1根長柱)
等效柱慣性矩(9根短柱合為1根長柱)
結(jié)構(gòu)側(cè)移比較如圖3所示。
從圖中可以看出：(1)等效后的結(jié)構(gòu)側(cè)移與原結(jié)構(gòu)的側(cè)移非常相近，說明采用簡化計算框架結(jié)構(gòu)側(cè)移是可行的。(2)簡化結(jié)構(gòu)1與簡化結(jié)構(gòu)2的側(cè)移相差也不大，說明框架結(jié)構(gòu)的側(cè)移計算誤差不會因為簡化程度加大而顯著增加，因此實際工程中，為最大限度的簡化，可將原來比較復(fù)雜的框架結(jié)構(gòu)按合并梁法做最大程度的簡化。
圖2 結(jié)構(gòu)計算簡圖
4 結(jié)論
第2篇：核酸檢測方法范文
關(guān)鍵詞：水環(huán)境 監(jiān)測 計算機 水質(zhì)
中圖分類號：X830 文獻標識碼：A 文章編號：1007-9416（2014）05-0091-01
水是人類及各種生物的生命之源，隨著水環(huán)境的逐漸惡化，國家對水環(huán)境的監(jiān)測越來越重視。我們國家首次真正意義上的開展環(huán)境保護工作是從1973年第一次全國環(huán)境保護大會開始的，如今，我國的水環(huán)境監(jiān)測經(jīng)歷了30多年的過程。水環(huán)境監(jiān)測是國家水資源管理與保護的基礎(chǔ)。我國水資源缺乏，水污染非常嚴重，水環(huán)境監(jiān)測提供的水質(zhì)數(shù)據(jù)非常重要。水環(huán)境監(jiān)測的目的是判別斷水環(huán)境的質(zhì)量狀況。水質(zhì)的好壞直接影響我們的生存環(huán)境。為了對水資源實施有效的管控，合理的保護、開發(fā)和利用水資源，需要及時掌握水環(huán)境的現(xiàn)狀。水質(zhì)監(jiān)測是對水環(huán)境中的污染物及污染因素進行監(jiān)測，監(jiān)測的目的是評價污物產(chǎn)生的原因及污染途徑，為防治污染提供技術(shù)支持。水環(huán)境控制目標的確定及水環(huán)境質(zhì)量狀況改善的效果要依靠水質(zhì)監(jiān)測。
1 水環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)的計算機處理
水質(zhì)動態(tài)信息是政府控制水污染實施監(jiān)督管理的依據(jù)。水質(zhì)是水中含有各種雜質(zhì)的共同表現(xiàn)出來的綜合特性。反映水質(zhì)狀況的綜合指標主要有總磷、總氮、氨氮、高錳酸鹽等特性指標。
水環(huán)境監(jiān)測的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證是實驗室水質(zhì)分析的主要工作之一，是水環(huán)境監(jiān)測工作中的關(guān)鍵技術(shù)和科學管理實驗室的有效方法，是獲得正確數(shù)據(jù)分析的一個非常重要環(huán)節(jié)。為了保證水質(zhì)監(jiān)測工作的科學性、公正性、合理性，使水環(huán)境監(jiān)測的數(shù)據(jù)能夠真實準確地反映水環(huán)境質(zhì)量的現(xiàn)狀及預(yù)測污染物的發(fā)展趨勢。從水質(zhì)評價的角度出發(fā)來分析水質(zhì)監(jiān)測數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制。
從水環(huán)境評價的方面考慮水質(zhì)監(jiān)測數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制，得出水質(zhì)監(jiān)測開始到結(jié)束的數(shù)據(jù)公布及解釋的過程中有可能存在的誤差來源及消除誤差的方法，并對工作現(xiàn)場質(zhì)量控制的主要原則、實驗室測定分析的基本要求、數(shù)據(jù)處理和保存的控制等方面做詳細的分析。
水環(huán)境監(jiān)測但是有時過于簡單，只是對照標準，對單個數(shù)據(jù)進行評價，判斷其是否超標。本文采用計算機來處理水環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)能夠直觀的反映當前水質(zhì)的各種綜合指標的變化情況，有利于察覺水環(huán)境的發(fā)展趨勢。
現(xiàn)在水環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)的處理方面還存在不少的問題，比如在水的樣品采集、實驗分析過程中的誤差，使監(jiān)測數(shù)據(jù)受到影響；在代表性的監(jiān)測數(shù)據(jù)控制方面不完善；缺乏必備的監(jiān)測數(shù)據(jù)綜合分析能力。
隨著信息時代的到來，計算機技術(shù)在各個領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。但是目前對水環(huán)境監(jiān)測方面的計算機分析軟件還十分缺乏，主要還是靠人工操作。水環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)的處理、匯總、分析及上報過程，還是要不斷地重復(fù)簡單枯燥的工作，整個匯總過程單調(diào)而繁瑣。沒有一種行之有效的計算方法對整個水環(huán)境監(jiān)測過程加以處理。
本文采用計算機數(shù)學軟件Matlab對石河監(jiān)測數(shù)據(jù)編程及處理，用以消除水環(huán)境監(jiān)測過程中的誤差，然后再采用EXCEL對數(shù)據(jù)進行繪圖，形成水環(huán)境長期的綜合指標的曲線圖，如圖1、圖2所示。然后對水環(huán)境質(zhì)量動態(tài)特征及其成因進行分析，可實現(xiàn)敏捷、準確的水環(huán)境預(yù)警。
通過對圖1分析得知，該水樣的水質(zhì)中總氮指標在第10天監(jiān)測時有超標的發(fā)展趨勢，有助于評價水體被污染和自凈狀況，微生物大量繁殖，浮游生物生長旺盛，出現(xiàn)富營養(yǎng)化狀態(tài)。圖2中綜合指標相對比較穩(wěn)定。
2 結(jié)語
本文研究了水環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)的計算機處理方法，通過該方法能直接、有效的發(fā)現(xiàn)水質(zhì)中重要綜合指標的發(fā)展趨勢，并應(yīng)用到石河的水環(huán)境監(jiān)測上，實踐證明該方法是直觀的、合理的。
參考文獻
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第3篇：核酸檢測方法范文
筆者通過對丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶篩查的微量檢測方法進行改進，不僅減小實驗誤差，降低試劑成本，方便操作，降低勞動強度，而且保證了檢測結(jié)果判斷的準確性，更加適合單采血漿和輸血單位對供血漿者（獻血者）丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶篩查。
1 原理
血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在一定的反應(yīng)條件下，作用于丙氨酸及α-酮戊二酸，生成一定量的丙酮酸及谷氨酸。2，4-二硝基苯肼能與反應(yīng)產(chǎn)生的丙酮酸及剩余的基質(zhì)α-酮戊二酸生成相應(yīng)的2，4-二硝基苯腙。后者在堿性條件下呈棕色，從而推算出酶的活力。
2 實驗準備
2.1 儀器、設(shè)備 雷勃10μl可調(diào)移液器；雷勃50μl連續(xù)分配器；722型分光光度計；全自動酶標測試儀（北京普朗）；電子微量分析天平（分光度值為0.1mg以下）；電熱恒溫箱；帶蓋空白酶標板（江蘇海門市博陽實驗器材廠生產(chǎn)）。
2.2 試劑 四川邁克生產(chǎn)的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測試劑。
2.3 操作 用電子微量分析天平精確稱取丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測試劑盒內(nèi)2mmol/L丙酮酸鈉標準液0.438g，加入0.562g蒸餾水配制成0.876mmol/L濃度混勻，密封保存，作為25單位丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶對照品使用。
2.4 樣品測定 按表1順序分別加入樣品、標準試劑進行操作，為減少實驗誤差，標準孔加3孔，酶標儀取其平均值自動計算。表1 樣品微量法測定操作過程
2、4-二硝基苯肼溶液
振蕩1min左右混勻，室溫靜置5～10min，492nm測定波長，630nm參考波長下，空白孔調(diào)零進行酶標比色。讀取各孔吸光度值A(chǔ)，大于標準孔讀數(shù)的機器自動打印“+”，表示不合格；小于等于標準孔讀數(shù)的機器自動打印“-”，表示合格［2］。
2.5 結(jié)果判定 被測樣本 ：≤25單位為合格，>25單位為不合格。
3 討論
本實驗與已發(fā)表文獻類似方法不同之處主要有以下幾個方面：第一是先加基質(zhì)，后加樣品，目的是為了減少實驗誤差，因為經(jīng)過實驗證明對20份同樣的樣品進行檢測，先加樣品后加基質(zhì)檢測結(jié)果的變異系數(shù)達到13.2%，而先加基質(zhì)，后加樣品檢測結(jié)果的變異系數(shù)僅有7.8%，原因可能是10μl的樣品量太少，容易干燥導(dǎo)致檢測結(jié)果不準確，基于本檢測方法是終點法，作為采漿單位目的是為了篩查出不合格的供血漿者，保證原料血漿的安全性，所以采用先加基質(zhì)，后加樣品的實驗步驟；第二是本方法不需要制作標準曲線，因為按照經(jīng)典的賴氏法對28單位的定義：試管法為50μl 2mmol/L丙酮酸鈉標準液，微量法所有試劑均為試管法加樣量的1/10，5μl就相當于28單位，經(jīng)過計算0.876mmol/L丙酮酸鈉標準液10μl就相當于微量法的25單位。前提是在25單位到28單位成近似線形［1］。這樣判斷結(jié)果就變得非常簡單：OD值比標準孔高的判斷為不合格，反之合格。既保留原始打印資料方便今后查找，又節(jié)省90%的試劑成本，經(jīng)過對1125樣品用微量法和試管法同時檢測，微量法檢測結(jié)果為小于25單位（OD值為標準孔的0.8～1倍）但是經(jīng)過試管法確定為大于25單位的有5例，不合格符合率達到99.6%，微量法檢測結(jié)果為大于25單位（OD值為標準孔的1～1.2倍）但是經(jīng)過試管法確定為小于25單位的有3例，合格符合率達到99.7%，解決辦法是建立灰區(qū)范圍（標準孔的0.8～1.2倍）用試管法確定。綜上所述，該方法更加適合采集原料血漿前的樣品篩查。
【參考文獻】
第4篇：核酸檢測方法范文
1材料和方法
1.1材料：選取我院臨床初篩檢測病例72例，其中男性40例，女性32例。年齡28-63歲，平均39歲。
1.2臨床癥狀：初期的開始癥狀像傷風、流感、全身疲勞無力、食欲減退、發(fā)熱、體重減少、隨著病情的加重，癥狀日見增多，如皮膚、粘膚出現(xiàn)白色念球菌感染，單純皰疹、帶狀皰疹、紫斑、血腫、血皰、滯血斑、皮膚容易損傷，傷后出血不止等。
1.3方法：目前作為診斷手段使用的檢測主要包括抗HIV病毒抗體檢測、核酸檢測和抗原檢測。其中對病毒抗體的檢測是艾滋病初篩實驗室常規(guī)使用的方法
1.3.1酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：目前應(yīng)用的ELISA法有8種之多。它們的特異性和敏感性超過99%。在一些特殊情況下，當抗體檢測無法滿足HIV感染診斷的需要時，病毒分離及測定、核酸檢測、抗原檢測可作為輔助手段使用，這包括對非典型血清學反應(yīng)樣品的診斷、HIV感染的窗口期診斷、新生兒早期診斷和對特殊樣品的診斷。
1.3.2明膠顆粒凝集法（PA）：它是快速、簡便的一種篩選方法。PA的基本過程是先將樣品稀釋，然后分別加入經(jīng)抗原致敏的和未致敏的明膠顆粒，混勻后保溫(一般為室溫)。當血清中有HIV抗體存在時，經(jīng)抗原致敏的明膠顆粒與抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，根據(jù)明膠顆粒在孔中的凝集情況判讀結(jié)果。PA操作簡便，無需特殊儀器設(shè)備，適合對少量標本的檢測。是對大量人群初篩實驗使用的方法，例公民義務(wù)獻血的初篩檢測。
1.3.3免疫熒光試驗(IFA)：基本原理為應(yīng)用H9或HUT78培養(yǎng)細胞作為載體，用HIV感染細胞，該細胞內(nèi)就會含有HIV抗原，將HIV感染的淋巴細胞涂于玻片上固定，制備為抗原片，加入待檢血清，待檢血清中的抗 HIV抗體與抗原結(jié)合后，再與熒光素標記的抗人Ig結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見到細胞內(nèi)有黃綠色熒光。
1.3.4免疫印跡試驗：主要用于確認試驗，基本原理是HIV全病毒抗原經(jīng)過SDSPAGE電泳，將分子量大小不等的蛋白帶分離開來，然后再把這些已經(jīng)分離的不同蛋白帶電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將此膜切割成條狀，每一條硝酸纖維素膜上均含有經(jīng)電泳分離過的HIV病毒抗原。將待檢血清樣品用稀釋液稀釋成1/100，再把它直接加到硝酸纖維素膜上，恒溫震蕩，使其充分接觸反應(yīng)，血清中若含有抗HIV抗體，就會與膜條上的抗原帶相結(jié)合并呈現(xiàn)紫褐色。此確認實驗室是初篩陽性的標本送檢省疾控的HIV確認實驗室或市疾控的HIV中心實驗室進行的。
1.3.5病毒核酸檢測：是通過檢測HIV RNA水平來反映病毒載量，具有很高的靈敏度，使用適時熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，能夠在HIV感染的前2周檢測到病毒核酸。病毒核酸檢測方法可用于HIV的早期診斷，如窗口期輔助診斷、病程監(jiān)控、指導(dǎo)治療方案及療效測定、預(yù)測疾病進程等。目前常用的測定方法有逆轉(zhuǎn)錄PCR實驗(RT PCR)、核酸序列擴增實驗(NASBA)、分支DNA雜交實驗(bDNA)等。使用高靈敏度的適時熒光PCR技術(shù)，能夠在HIV感染的前2周檢測到病毒核酸。此種檢測是在HIV感染確診之后，判定使用抗病毒藥物的檢測指標，現(xiàn)在可有省疾控中心的艾滋病檢測實驗室完成。
2結(jié)果
經(jīng)過我院的檢測和分析后，14例送檢經(jīng)確認實驗，未確診艾滋病感染。
3討論
近年來，HIV檢測技術(shù)取得了很大進展，但是仍有不足的地方。例如ELISA法第四代試劑增加了P24抗原的檢測， p24抗原檢測能夠在病毒開始復(fù)制后檢測到血液中的可溶性p24抗原，但易出現(xiàn)假陽性。因此，陽性結(jié)果必須經(jīng)中和試驗確認，該結(jié)果才可作為HIV感染的輔助診斷依據(jù)。還有病毒核酸檢測方法具有很高的靈敏度，對疾病進展的監(jiān)測、抗病毒療效觀察和耐藥性監(jiān)測非常重要。但是，由于HIV基因的多樣性，沒有一套引物可以覆蓋所有的HIV序列，使檢測的敏感性又受到限制。
HIV感染的診斷是艾滋病預(yù)防控制工作的重要組成部分，建立敏感實用的檢測方法對于監(jiān)測、診斷或血液篩查，控制艾滋病的流行顯得尤為重要?？偨Y(jié)以上討論的檢測方法，我們得出的結(jié)論是，既要提高檢測的敏感性、特異性，縮短窗口期，又要簡便、快速和降低成本已成為HIV檢測技術(shù)發(fā)展的要求和方向，很多的研究正致力于尋找病毒檢測的替代技術(shù)。
參考文獻
[1]曹韻貞
我國艾滋病的現(xiàn)狀
中國抗感染化療雜志 2002，2(2):65 66
[2]沈霞
第5篇：核酸檢測方法范文
關(guān)鍵詞：多色熔解曲線分析 Gene-Xpert 微孔板 肺結(jié)核 利福平 耐藥
Study on the clinical application of different detection methods in the rapid diagnosis of tuberculosis resistance to rifampicin
BAO Xundi WANG Qing WANG Shu XU Dongfang LIANG Suo JIANG Yue
Department of Clinical Laboratory,Anhui Chest Hospital/Anhui Provincial Institute of Tuberculosis Prevention and Control;
Abstract：
Objective To evaluate the efficacy and application value of different tuberculosis laboratory testing methods in the rapid diagnosis of rifampicin(RFP) resistance in tuberculosis patients.Methods Sputum or alveolar lavage fluid samples from pulmonary tuberculosis patients treated in the hospital from January to July 2020 were collected.Different detection methods were used for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and RFP resistance, and the detection efficiency of different detection methods in rapid diagnosis of Mycobacterium tuberculosis and RFP resistance was evaluated.Results The results of RFP susceptibility test were obtained by multicolor melting curve analysis(MMCA),Gene-Xpert and microplate(MIC) in 77 cases.There was no significant difference in the drug resistance rate of Mycobacterium tuberculosis to RFP(38.96%,33.77% and 35.06%) among the three detection methods(P>0.05).There was no significant difference in the drug resistance rate of Mycobacterium tuberculosis to RFP among patients with different gender, age and bacterial samples(P>0.05).Conclusion MMCA method, Gene-Xpert method and MIC method have no significant difference in the clinical detection of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis to RFP.They all have high sensitivity and specificity.The drug sensitivity detection technology can be selected according to the actual clinical needs.
Keyword：
multicolor melting curve analysis; Gene-Xpert; microplate; tuberculosis; rifampicin; drug resistance;
結(jié)核病是一種全球感染人數(shù)最多，經(jīng)呼吸系統(tǒng)傳播的疾病，已成為全球十大死亡原因之一。近年來，隨著耐藥結(jié)核病的日益增多，結(jié)核病的疫情防控工作從各方面都面臨著巨大挑戰(zhàn)[1-2]。根據(jù)我國第5次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查和第1次耐藥結(jié)核病基線調(diào)查數(shù)據(jù)[3-4],我國每年大約新發(fā)結(jié)核病患者約93萬人，估算耐多藥結(jié)核病患者約5.2萬人[5]。有研究指出，耐利福平(RFP)患者大部分為耐多藥結(jié)核病患者，因此，世界衛(wèi)生組織(WHO)在耐多藥結(jié)核病患者中發(fā)現(xiàn)，近期耐RFP患者即可按照耐多藥結(jié)核病患者進行治療。耐藥結(jié)核病的診斷主要依賴于結(jié)核分枝菌藥物敏感(簡稱藥敏)試驗，傳統(tǒng)的細菌學藥敏試驗是目前診斷耐藥結(jié)核病的“金標準”,但傳統(tǒng)藥敏試驗時間長，影響耐藥結(jié)核病的防控、及時診斷和治療工作。因此，結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的早期快速診斷對結(jié)核病疫情控制起著至關(guān)重要的作用。
進入21世紀，隨著分子生物學檢測技術(shù)的飛速發(fā)展，結(jié)核分枝桿菌和RFP耐藥基因的快速檢測均有成熟易用的技術(shù)在推廣使用。多色熔解曲線分析(MMCA)法為我國自主研發(fā)技術(shù)，可同時進行結(jié)核分枝桿菌和多種抗結(jié)核藥物的快速檢測[6-7];Gene-Xpert法為WHO推廣使用的快速檢測技術(shù)，同樣可同時進行結(jié)核分枝桿菌和RFP耐藥基因的檢測。這兩種方法均為DNA擴增檢測技術(shù)，具有操作相對簡單、靈敏度高、特異度高等特點[8-9]。微孔板(MIC)法是近幾年報道的一種細菌學藥敏檢測方法，利用MIC中加入抗結(jié)核藥物進行藥敏檢測，可縮短耐藥檢測時間[10]。本研究采用這3種檢測方法對肺結(jié)核患者進行結(jié)核分枝桿菌和RFP耐藥的快速診斷，以評估這3種檢測方法在結(jié)核分枝桿菌和RFP耐藥快速診斷中的檢測效能，進一步分析其在結(jié)核病和耐藥結(jié)核病控制中的應(yīng)用價值。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集2020年1-7月在本院就診的300例肺結(jié)核患者作為研究對象。300例患者中男214例，平均年齡(49.72±19.12)歲；女86例，平均年齡(43.77±20.06)歲。
1.2 儀器與試劑
Gene-Xpert法檢測儀器GeneXpert及配套試劑盒購自美國Cepheid公司，MMCA法結(jié)核分枝桿菌耐藥突變檢測儀器SLAN-96S及配套試劑盒購自廈門致善生物科技有限公司，MIC法結(jié)核藥敏檢測儀器YK960及配套試劑盒購自珠海市銀科醫(yī)學工程股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 標本采集
采集肺結(jié)核患者的痰或肺泡灌洗液標本，按照結(jié)核病實驗室標準操作流程采用MMCA法、Gene-Xpert法檢測RFP耐藥性，同時進行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性菌株再進行MIC法檢測RFP耐藥性。
1.3.2 結(jié)核分枝桿菌和RFP耐藥檢測方法
(1)MMCA法：取標本1～2 mL,加入1～2倍標本前處理液處理，以12 000×g離心15 min, 磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸后洗滌，12 000×g離心5 min, 棄上清液，加入核酸提取液，上核酸提取儀進行核酸提取，提取后的DNA按照試劑盒說明書進行檢測，由儀器根據(jù)核酸解鏈溫度自動判讀結(jié)果。(2)Gene-Xpert法：取待檢標本2 mL,加入1～2倍標本前處理液處理，消化處理15 min后，按照試劑盒操作說明書進行操作，由儀器自動判讀結(jié)果，結(jié)核分枝桿菌半定量檢測結(jié)果分為陰性、極低、低、中、高5個菌量級別，RFP耐藥檢測結(jié)果分為耐藥、敏感。(3)MIC法檢測：取患者1～2周內(nèi)培養(yǎng)陽性菌株，根據(jù)操作說明書，將菌株進行比濁定量，加入MIC相應(yīng)藥敏檢測位置，37 ℃培養(yǎng)10～14 d后，由儀器判讀藥敏試驗結(jié)果。
1.4 統(tǒng)計學處理
將數(shù)據(jù)錄入EXCEL2016,使用spss19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析、處理。正態(tài)分布的計量資料以xˉ±s表示。計數(shù)資料以頻數(shù)、率表示，組間比較采用χ2檢驗，如理論數(shù)T≥5且總樣本量n≥40,組間比較采用χ2檢驗；如理論數(shù)T<5但T≥1,且≥40,組間比較采用連續(xù)性校正的χ2檢驗；如理論數(shù)T<1或n<40,組間比較則用Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結(jié) 果
2.1 3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌RFP藥敏試驗結(jié)果
采用MMCA法、Gene-Xpert法、MIC法對300例肺結(jié)核患者標本進行檢測，MMCA法獲得132例藥敏試驗結(jié)果，Gene-Xpert法獲得192例藥敏試驗結(jié)果，MIC法獲得201例藥敏試驗結(jié)果。3種檢測方法均獲得結(jié)核分枝桿菌RFP藥敏試驗結(jié)果的患者有77例，其中有63例繼發(fā)性肺結(jié)核、12例空洞型肺結(jié)核、2例浸潤性肺結(jié)核；40例為復(fù)治結(jié)核病患者。3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。
表1 3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌RFP藥敏試驗結(jié)果
2.2 不同性別患者3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥情況比較
3種檢測方法均獲得結(jié)核分枝桿菌RFP藥敏試驗結(jié)果的77例患者中，男53例，女24例。不同性別患者3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。
表2 不同性別患者3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥情況比較[n(%)]
2.3 不同年齡組患者3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥情況比較
將3種檢測方法均獲得結(jié)核分枝桿菌RFP藥敏試驗結(jié)果的77例患者分為≤25歲、>25～50歲、>50歲3個年齡組。不同年齡組患者3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表3。
表3 不同年齡組患者3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌 對RFP的耐藥情況比較[n(%)]
2.4 不同菌量標本3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥情況比較
將3種檢測方法均獲得結(jié)核分枝桿菌RFP藥敏試驗結(jié)果的77例患者標本按照菌量分為高、中、低、極低菌量4個級別，不同菌量標本3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表4。
表4 不同菌量3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的 耐藥情況比較[n(%)]
3 討 論
自我國開始結(jié)核病的規(guī)范化管理治療以來，結(jié)核患者一直能夠得到國家規(guī)范化的免費抗結(jié)核治療。雖然經(jīng)過近20年的規(guī)范化管理治療，但我國的結(jié)核病患者數(shù)量并沒有明顯下降，目前居全球第2位。隨著實驗室檢測技術(shù)的發(fā)展，越來越多的耐藥結(jié)核病患者被發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌耐藥株的傳播也導(dǎo)致了我國耐藥結(jié)核病患者數(shù)量居高不下[11],使我國成為全球耐藥結(jié)核病高負擔國家之一。RFP是目前結(jié)核病治療中最常用，也是最重要的一種藥物。根據(jù)WHO的推薦，耐RFP的結(jié)核病患者可按照耐多藥結(jié)核病患者進行治療，因此，RFP耐藥情況檢測在肺結(jié)核患者中至關(guān)重要。
本研究中，3種檢測方法均獲得結(jié)核分枝桿菌RFP藥敏試驗結(jié)果的患者有77例，其中有63例繼發(fā)性肺結(jié)核、12例空洞型肺結(jié)核、2例浸潤性肺結(jié)核；40例為復(fù)治結(jié)核病患者。由于本院是省級結(jié)核病定點醫(yī)院，收治的多是復(fù)治、耐藥結(jié)核病患者，故本研究中RFP耐藥率高于全國平均水平，但與全國復(fù)治結(jié)核患者RFP耐藥率基本一致[4]。
目前，常見的實驗室結(jié)核分枝桿菌耐藥株檢測方法有傳統(tǒng)的細菌學藥敏檢測技術(shù)、液體藥敏檢測技術(shù)、分子生物學耐藥快速篩查等技術(shù)[12-15]。傳統(tǒng)的細菌學藥敏檢測技術(shù)的缺點是耗時長，但液體藥敏檢測技術(shù)縮短了這一時間，MIC法僅需7～10 d即可報告藥敏試驗結(jié)果。而分子生物學方法1 d內(nèi)即可獲得藥敏檢測結(jié)果，常用的分子生物學檢測技術(shù)有MMCA法、Gene-Xpert法、線性探針、基因芯片等，它們主要通過檢測結(jié)核分枝桿菌的特異性靶基因是否存在基因突變來評估結(jié)核分枝桿菌對相應(yīng)藥物的耐藥性，而且自動化程度高，檢測結(jié)果與傳統(tǒng)細菌學藥敏試驗結(jié)果基本一致，故在臨床逐漸被接受和推廣。
本研究結(jié)果顯示，MMCA法檢測結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥率最高，MIC法次之，Gene-Xpert法最低，但三者的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);而且在不同性別和年齡段患者中，結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥率差異也均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對于分子生物學檢測，菌量是不可忽視的一個問題，含菌量低的標本可能導(dǎo)致核酸提取的假陰性；而含菌量高的標本，因野生型模板背景較高時，易導(dǎo)致非特異性擴增，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。這些原因都可能導(dǎo)致表型藥敏試驗和分子藥敏試驗結(jié)果不一致。基于核酸的堿基突變檢測也不能完全覆蓋所有的基因突變位點，也有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的存在。因此，可以利用分子藥敏試驗和表型藥敏試驗互補的檢測方法進行藥敏試驗篩查，提高檢測靈敏度和特異度。本研究中結(jié)果顯示，不同菌量標本3種檢測方法結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),這可能與樣本量較少有關(guān)，后期可以加大樣本量進行研究，進而發(fā)現(xiàn)分子藥敏試驗和表型藥敏試驗之間的差異。
MMCA法和Gene-Xpert法均是通過檢測RFP的rpoB基因上的507～533共81 bp耐藥決定區(qū)的基因序列，通過檢測堿基突變來確定RFP的耐藥信息，與傳統(tǒng)的細菌學藥敏試驗相比，有較好的一致性，且靈敏度和特異度均較高，能夠在短時間內(nèi)檢測出RFP的耐藥基因rpoB的突變信息。MIC法是通過抗結(jié)核藥物技術(shù)處理后按照一定的藥物濃度加入MIC中，再加入一定量的結(jié)核分枝桿菌，經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)，從而判斷結(jié)核分枝桿菌是否對該藥物耐藥的一種新型細菌學耐藥檢測技術(shù)[16]。該方法受MIC加工工藝和藥粉質(zhì)量的影響，對藥敏試驗結(jié)果可能會存在一定的影響，因此，目前應(yīng)加強MIC的質(zhì)量控制工作。本研究在藥敏試驗檢測過程中，參加了中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室的藥敏試驗室間質(zhì)量控制，取得了優(yōu)秀成績，但此次質(zhì)量控制覆蓋的藥物種類較少，主要是常見的抗結(jié)核藥物，質(zhì)量控制藥物較少，這也是結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗檢測室間質(zhì)量控制的發(fā)展方向。
此外，MMCA法、Gene-Xpert法、MIC法3種方法在檢測時間、檢測費用、人力成本方面也有區(qū)別，3種方法都是結(jié)核分枝桿菌的新檢測技術(shù)，需要經(jīng)過培訓的專業(yè)技術(shù)人員進行操作。MMCA法和Gene-Xpert法是分子生物學檢測技術(shù)，檢測時間均短于細菌學檢測技術(shù)MIC法；檢測費用Gene-Xpert法最高，MIC法最低。這3種方法需要臨床醫(yī)生根據(jù)患者病情和其他多方面因素進行選擇，并可在耐多藥結(jié)核病防治領(lǐng)域中進行推廣和應(yīng)用[17]。
綜上所述，MMCA法、Gene-Xpert法和MIC法在臨床上檢測結(jié)核分枝桿菌對RFP的耐藥性結(jié)果無明顯差異，均具有較高的靈敏度和特異度，可結(jié)合臨床實際需求選擇藥敏檢測技術(shù)。
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第6篇：核酸檢測方法范文
[關(guān)鍵詞]核酸檢測；血液篩查；輸血風險；血液安全；轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增技術(shù)
輸血相關(guān)傳染病的預(yù)防和控制是全社會關(guān)注的焦點之一。2010年，國家衛(wèi)生與計劃生育委員會（原衛(wèi)生部）確定在全國15家采供血機構(gòu)開展核酸檢測（NAT）試點工作，以進一步保證血液檢測質(zhì)量，提升我國無償獻血者血液檢測水平。到目前NAT技術(shù)已經(jīng)廣泛運用于全國各地血站的血液篩檢。該技術(shù)的檢測靈敏度較ELISA檢測方法高，能顯著縮短病原體檢測的窗口期，從而降低輸血傳播病毒的殘余風險50%以上。但NAT技術(shù)從理論上并不能完全消除“窗口期”，國外已有經(jīng)核酸檢測后仍發(fā)生輸血后感染的病例報道，包括HIV和HBV。本中心2010年11月正式將NAT技術(shù)應(yīng)用于血液篩查項目中，對全部無償獻血者血液標本進行HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA核酸檢測。本研究通過對無償獻血者血液標本的常規(guī)血清學及核酸檢測結(jié)果的分析，以評估核酸檢測的檢測功效，以及本地獻血者人群的感染狀況?，F(xiàn)將檢測結(jié)果報道如下。
1資料與方法
1.1一般資料
2011年1月～2014年12月，廣州血液中心采集的無償獻血者血液標本1146740例。所有無償獻血者均符合現(xiàn)行的衛(wèi)生部《獻血者健康檢查要求》（GB18467-2011）。血液采集后同時留取核酸檢測標本和酶免檢測標本管各一支。核酸檢測標本采集、保存和處理等均嚴格按照衛(wèi)生部核酸檢測試點技術(shù)要求操作。
1.2主要儀器與試劑
核酸檢測儀器：Grifols公司（原諾華診斷公司）PROCLEIX TIGRIS全自動核酸檢測分析系統(tǒng)，試劑配置恒溫箱（RPI）。試劑為PROCLEIXULTRIO Assay核酸聯(lián)檢試劑盒和核酸鑒別試劑盒（Discriminatory Assay）。核酸檢測試劑批號：（593226，614952，624775，116153等）。血清學檢測儀器：STAR全自動加樣儀和全自動酶聯(lián)免疫分析儀（FAME24/30）。ELISA檢測主要試劑包括乙肝表面抗原試劑盒（法國梅里埃，批號B11FA，20110704；上?？迫A：批號201101031，201201011，201302011）、丙型肝炎抗體試劑盒（美國強生ORTHO：批號EXE187，EXE208；上?？迫A：批號201103011，201202031，201303011）及人類免疫缺陷病毒（HIVl/2）抗原抗體檢測試劑盒（法國伯樂，批號1F0189，280213，3F0259；北京萬泰，批號1201 10204，120121 120，12013 1022）。
1.3檢測策略
血液標本采用血清學和NAT并行檢測操作策略；對核酸檢測單獨反應(yīng)性標本進行分項鑒別試驗。
1.4檢測方法
采用PROCLEIX TIGRIS 全自動核酸檢測分析系統(tǒng)（TMA方法）對血液核酸標本進行單人份聯(lián)合檢測（HIV-1/HCV/HBV）；對核酸檢測單獨反應(yīng)性標本進行分項鑒別試驗；核酸檢測結(jié)果反應(yīng)性結(jié)果由檢測系統(tǒng)軟件自動判定，其判定標準為樣本的S/CO值≥1。采用兩種不同廠家的ELISA試劑對獻血者標本進行血清學HBsAg、HCVAb、HIVAgAb檢測，嚴格執(zhí)行說明書進行相關(guān)操作，通過陰陽性對照及室內(nèi)質(zhì)控品來控制試劑盒的質(zhì)量和檢測的有效性；血清學檢測結(jié)果陽性的判定：樣本OD≥cut off值。
1.5檢測原理
Grifols核酸檢測試劑是以轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增（transcription-mediated amplification，TMA）技術(shù)原理來檢測病毒核酸的方法。其檢測基本原理是：利用特異性的目標捕獲試劑和磁微珠分離純化被檢測病毒核酸分子，再通過TMA技術(shù)來擴增HBVDNA、HCV RNA和HIV-1 RNA（1型）的核酸片斷，最后通過雜交保護（HPA）方法檢測擴增產(chǎn)物。試劑中含有內(nèi)標分子，用以監(jiān)測整個反應(yīng)過程，避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
1.6統(tǒng)計學方法
采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理和分析，對計數(shù)資料進行x2檢驗，P
2結(jié)果
2.1血清學與核酸檢測結(jié)果的比較
對1 146 740例獻血者血液標本，核酸檢測的陽性檢出率為0.97%，低于血清學（HBsAg，HCVAb，H1VAbAg三項之和）的檢測陽性率1.66%，二者之間的差異具有統(tǒng)計學意義（x2=2128.4，P
2.2核酸檢測
4年中Grifols單人份核酸檢測系統(tǒng)的總陽性率為0.97%，并且陽性率呈現(xiàn)逐年緩慢增加的趨勢。在對每年的檢測陽性率進行比較時，各年度間檢測陽性率未見統(tǒng)計學意義（x2=2.442，P
2.3血清學合格標本中核酸檢測情況
在1114428例血清學檢測合格標本中，單人份核酸檢測共檢出2457例核酸反應(yīng)性樣本，核酸單獨反應(yīng)性比率為0.22%；在對每年檢測陽性率進行比較時，各年度間血清學檢測合格標本其NAT檢測陽性率之間的差異具有統(tǒng)計學意義（x2=16.506，P
2.4核酸鑒別結(jié)果
在2457例核酸單獨反應(yīng)性標本中，鑒別試驗反應(yīng)性的樣本為718例，其中，HBV-DNA 711例，HCV-RNA 4例，HIV-RNA 3例，獻血者中核酸單獨陽性的樣本大多屬于HBV感染，HBV DNA鑒別陽性率與另外兩者間的差異具有統(tǒng)計學意義（x2=2091.464，P
3討論
目前，國內(nèi)外應(yīng)用于血液篩查的核酸檢測技術(shù)主要有TMA及PCR兩種。我中心使用的是Grills公司基于TMA技術(shù)的核酸檢測試劑，對全部獻血者樣本進行單人份核酸檢測。這種檢測方法的靈敏度高，反應(yīng)條件簡單，擴增效率高，可以防止低拷貝的病毒陽性血液的漏檢。其分析靈敏度為：HBVDNA 10.4IU/mL，HCV RNA 3.0IU/mL和HIV RNA45.0IU/mL。并且該方法的整個反應(yīng)過程在1個試管中進行，因此也減少了污染發(fā)生的可能。本研究顯示，廣州地區(qū)無償獻血者血液標本的核酸陽性檢出率明顯低于酶免檢測項目陽性檢出率（P
在獻血者血液篩查中引入核酸檢測技術(shù)，其主要目的是檢測出原有血清學檢測可能漏掉的具有感染性的獻血者樣本。在本研究中的1114428份血清學檢測合格標本中，單人份核酸檢測共檢測出反應(yīng)性樣本2475例，陽性檢出率為0.22%（2457/1114428），結(jié)果明顯高于大連和沈陽地區(qū)0.07%，這可能與各地區(qū)病毒流行率差異、檢測樣本數(shù)量、使用試劑差異，以及檢測模式（單人份與多人份混樣檢測）不同有關(guān)。在對這些核酸單獨陽性樣本的鑒別檢測中，共檢出718例陽性結(jié)果，鑒別陽性檢出率為29.22%。這個鑒別率與汪德海等報道的一致，而低于大連，杭州等地的數(shù)據(jù)。而出現(xiàn)核酸檢測聯(lián)檢反應(yīng)性，而鑒別試驗全部為非反應(yīng)性的原因可能有：（1）聯(lián)檢結(jié)果假陽性。這可能是由于酶免及核酸檢測平行進行，檢測人員若操作不規(guī)范，導(dǎo)致陽性標本的小范圍污染，增加聯(lián)檢結(jié)果假陽性的可能；或由于檢測試劑本身的非特異性反應(yīng)。（2）鑒別試驗的假陰性。如病毒濃度處于極低的濃度水平，由于病毒顆粒在血漿中的泊松分布，導(dǎo)致取樣時未能吸取到帶有病毒的樣本；或可能是因不合適的儲存條件，不良的運送，干擾物質(zhì)的存在，導(dǎo)致樣本中病毒的降解，也會造成鑒別試驗假陰性的結(jié)果。由于我國乙肝的流行率相對較高，因此獻血者中核酸單獨陽性的樣本大多屬于HBV感染。而HBV感染，特別是隱匿性乙肝感染（OBI）的病毒濃度通常很低，因此出現(xiàn)上述低濃度樣本的可能性很大。已有文章報道，對于不可鑒別的樣本，采用其他核酸檢測方法，或乙肝感染標志物（如乙肝核心抗體）進行檢測時，部分樣本仍然呈現(xiàn)陽性結(jié)果。提示這些不可鑒別的樣本中存在一定比例的真陽性。
第7篇：核酸檢測方法范文
禽流行性感冒病毒簡稱禽流感病毒(AIV)，屬于正粘病毒科、流感病毒屬。流感病毒根據(jù)可溶性抗原不同可分為A、B、C 3型，只有 A 型(AIV)易變異［1］，并可在禽、人、豬、馬和海洋哺乳動物中暴發(fā)流行，出現(xiàn)輕度呼吸疾病到嚴重敗血癥等。1878 年 AIV 在意大利首次暴發(fā)，其后在英、法、德等歐洲國家和美國均有流行。高致病性 AIV H5N1 于 1997 年在香港致 6 人死亡，2003～2004 年在亞洲致 4 人死亡，2003 年 H7N7 在荷蘭致 1 人死亡［2］。AIV 給人類健康已帶來嚴重威脅，引起全球的極大關(guān)注，AIV 檢測技術(shù)也隨之成為人們研究的熱點?，F(xiàn)就近年來 AIV檢測技術(shù)研究進展作一綜述。
1 病原學檢測
雞胚分離培養(yǎng)是檢測病禽組織中AIV的一種經(jīng)典、準確、敏感的病原學診斷方法，可以作為金標準，特異性和敏感度均可以達到100%［2］。
2 血清學檢測
21 病毒中和試驗（NT） 作為經(jīng)典方法，病毒中和實驗操作繁瑣、耗時、費料，臨床幾乎不用。
22 血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗AIV 能夠與雞紅細胞發(fā)生凝集現(xiàn)象，這種紅細胞凝集現(xiàn)象又可被特異性免疫血清所抑制，即紅細胞凝集抑制試驗。血凝和血凝抑制試驗可以鑒定病毒、檢測血清中的抗體水平。用抗不同血凝素的抗血清，由血凝抑制試驗來確定HA亞型。
23 神經(jīng)氨酸酶抑制（NI）試驗微量神經(jīng)氨酸酶（NA）抑制劑抑制NA的活性，并以半抑制濃度IC50鑒定NA亞型。Hurt等［3］用5mg的抗病毒藥物zanamivir建立的熒光NI試驗，檢測陽性樣本H1N1、H1N2，符合率分別為N1 955%，N2 897%，平均935%（187/200）。該方法成本低，適于大規(guī)模地應(yīng)用。
24 瓊脂凝膠擴散試驗（AGP） 用于檢測AIV共同抗原核蛋白或基質(zhì)蛋白。由于所有的AIV 都具有型特異性共同抗原，用一種AIV的抗原或抗血清就可對所有AIV 的抗體或抗原進行鑒定。免疫雙向擴散及免疫電泳中以沉淀線判定可以定性，免疫單輻射擴散試驗可以定量。
25 免疫熒光技術(shù)(IFT) 將抗原或抗體標記上熒光素，再進行抗原抗體反應(yīng)。最早用于流感病毒是鑒定和定位病毒感染細胞異性的抗原、核蛋白(NP)或基質(zhì)蛋白(MP)抗原。用NP抗原的熒光抗體染色，主要出現(xiàn)核內(nèi)熒光；用MP抗原的熒光抗體主要出現(xiàn)胞質(zhì)熒光，核內(nèi)也可出現(xiàn)部分熒光。
26 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 運用ELISA原理建立的AIV檢測方法較多，如用單克隆抗體介導(dǎo)的、經(jīng)生物素一親和素系統(tǒng)放大的H5亞型禽流感病毒捕獲ELISA檢測方法，為進一步研究檢測試劑盒提供基礎(chǔ)［4］。AIV抗體膠體金檢測試紙條則是膠體金免疫層析分析法，用純化病毒與膠體金顆粒偶聯(lián)，吸附在玻璃纖維上制作而成，不需要其他試劑，一步完成，反應(yīng)時間只需要幾分鐘(5～10min)，是一種檢測微量AIV抗體快速、簡便的方法［5］。鄭其升等［6］用基因工程重組HA蛋白作為抗原建立了檢測AIV 抗體的間接ELISA方法，可以檢測H3、H5、H7、H9亞型血清，特異性高，與傳統(tǒng)HI方法比較，符合率為 971%（774/807）?；谥亟MHA蛋白的間接ELISA方法可望用于AIV的保護性抗體水平檢測。
3 單鏈構(gòu)型多態(tài)性(SSCP)
作為檢測基因變異的手段已得到廣泛應(yīng)用，其原理是單個核苷酸的置換引起DNA單鏈構(gòu)象改變，在非變性電泳中足以導(dǎo)致泳動率變化。Quinto等［7］用高通量 SSCP 與限制性片段長度多性（RFLP）分析法對照，檢測了近50株流感病毒的400多個基因片段，符合率為98%。
4 核酸擴增方法
41 RTPCR基于MP、NP 基因的高度保守區(qū)的引物，RTPCR可以鑒定AIV［810］。Lee等［9］在此基礎(chǔ)上針對H1～H15又分別設(shè)計了15對HA基因的特異性引物，同時進行15管RTPCR，可以檢測H1H15的HA亞型，該法所測80株病毒樣品，與血清學方法符合率為100%。但單管單測，操作繁瑣。Phipps等［11］建立了相對簡便的RTPCR的AIV檢測法，僅用一對引物擴增出H1～H15的HA2基因，產(chǎn)物由雙脫氧核酸鏈中止法測序分析，盲測12株標準病毒和30株樣品病毒，并與HI對照，完全相符。為提高擴增的靈敏度和特異性，也可采用巢式或半巢式RTPCR［8］。
42 多重RTPCR(mRTPCR)mRTRCR是在RTPCR基礎(chǔ)之上實現(xiàn)單管多檢的相對快速和經(jīng)濟的檢測方法。 Malik等［12］建立的mRTPCR方法，檢測3種不同的鳥類呼吸道病毒，與單管單檢RTPCR方法結(jié)果完全相符。Yamada等［13］ 建立了包括5對引物的mRTPCR體系，可鑒別5種亞型AIV。BellauPujol等［14］運用多重半巢式RTPCR可以檢測包括AIV的12種呼吸道RNA病毒，使檢測范圍進一步擴展，其203個樣本與培養(yǎng)方法及直接免疫熒光法對照，綜合敏感度為98%。
43 Realtime RTPCR(RRTPCR)運用特異性的熒光水解探針的RRTPCR方法可使檢測時間縮短為4 h ［10，15］。Lee等［10］建立的檢測H5、H7亞型AIV的RRTPCR方法，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法比較，并以EID50（50%雞胚致病指數(shù)）為評價指標，呈正相關(guān)（r = 0972），T 檢驗無顯著差別（P >021）。其重復(fù)性試驗呈正相關(guān)（r = 0902），靈敏度H5為1 fg或 102 RNA拷貝，H7為10-1 fg或10 RNA拷貝，所測病毒濃度均低于1010 EID50，該靈敏度高于培養(yǎng)方法。
44 依賴核酸序列的擴增（NASBA）NASBA是一種快速、等溫的RNA 擴增技術(shù)，整個反應(yīng)有賴于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、T7 RNA 多聚酶和核酸酶H(RNase H)共同協(xié)作而完成，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)，是以轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)，單鏈核苷酸的連續(xù)擴增，其反應(yīng)產(chǎn)物是單鏈RNA。擴增產(chǎn)物與磁珠上的捕捉探針及釕標記的電化學發(fā)光寡核苷酸探針雜交后，形成復(fù)合物，經(jīng)NucliSens閱讀器直接檢測電化學發(fā)光強度［1617］。Collins等［16］檢測了亞歐地區(qū)H5亞型AIV，同時還鑒別出高致病及低致病H5亞型。Lau 等［17］建立的NASBA技術(shù)可以檢測H1～H15亞型的AIV，并能區(qū)分出H5及H7亞型，整個過程從核酸分離、擴增、檢測在6 h 以內(nèi)，靈敏度與雞胚培養(yǎng)相當。
45 環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增（loopmediated isothermal amplification， LAMP）
Poon等［18］介紹了一種新的更加簡便的擴增方法，即環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增，特異性地針對6個獨立的結(jié)合位點設(shè)計兩對引物擴增，以看家基因或外源性RNA分子作為陽性對照。由于反應(yīng)中產(chǎn)生大量焦磷酸鎂，可以肉眼判斷結(jié)果，無需凝膠電泳。作者用該方法檢測了SARS病毒后，又檢測了H1～H3的AIV，與常規(guī)方法比較符合率為100%。
5 基因芯片
將RTPCR獲得的cDNA固化于芯片，利用核酸探針技術(shù)構(gòu)建的檢測流感病毒A、B及其亞型的芯片平臺， Cy3、Cy5標記的核酸探針與靶DNA雜交，可以進一步鑒別混合體系中擴增產(chǎn)物。Li等［19］用cDNA芯片及mRTPCR對流感病毒進行檢測及分型，結(jié)果顯示cDNA芯片為基于PCR的診斷技術(shù)提供了補充，因為基于PCR的方法，直接從DNA擴增片段大小不足以證明是目的產(chǎn)物。王秀榮等［20］依據(jù)M蛋白進行基因型別鑒定和HA基因亞型鑒定，用Cy5熒光標記，在基因芯片平臺上構(gòu)建檢測H5、H7、H9亞型禽流感病毒(AIV)的實驗技術(shù)模型，檢測AIV的cDNA，雜交達到預(yù)期結(jié)果。Kessler等［21］考慮到三維芯片潛在的優(yōu)勢（因其增加了幾何面積，使反應(yīng)效率提高，同時動態(tài)的流質(zhì)也使雜交時間縮短），將芯片技術(shù)進一步改進，建立了檢測流感病毒A、B的三維芯片平臺，通過比較實驗，選擇了特異性強的隨機 RTPCR 擴增方法，和低背景的化學發(fā)光檢測方法，檢測了AIV （H1N1、H1N2、H3N2、H5N1）和流感病毒B，特異性好，全部檢測過程不超過5 h。
轉(zhuǎn)貼于 6 展望
病毒分離培養(yǎng)和血凝抑制試驗經(jīng)常作為評價新的檢測 AIV方法的對照，但病毒分離培養(yǎng)耗時長，至少需7 d，不利于快速診斷，病毒分離的實驗條件要求較高，同時有高致病性的危險，對毒株的檢測及管理上要嚴格考慮生物安全措施。AIV在雞胚培養(yǎng)過程中還可能發(fā)生發(fā)生變異［22］。血凝及血凝抑制試驗特異性好，但其操作相對繁瑣，同時必須具備一定血凝效價的標準病毒和新鮮制備的紅細胞。血清學檢查對最后確診有回顧性診斷價值，一般只能在發(fā)病23周甚至更長時間才能有抗體陽性出現(xiàn)［17］。由于 AIV 血清型眾多，新的變異株不斷出現(xiàn)，制備血清型特異性單克隆抗體相對困難，且在各種免疫接種的情況下，血凝抑制試驗等血清學診斷方法也會失去作用。核酸擴增技術(shù)（NAT）檢測 AIV，選擇好靶基因和引物及優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)，均可獲得高靈敏度和特異性［23］。對于血清型眾多的 AIV，不同亞型致病性不同，宿主分布不同，故快速、特異地分型在 AIV 診斷中顯得尤為重要，而當前的核酸擴增技術(shù)尚不能高通量地鑒別出所有 HA 或 NA 的已知亞型。RTPCR 方法能夠獲得所有 AIV 的已知 HA 亞型，但最終結(jié)果尚需借助測序方法［10］，不能作為常規(guī)檢測手段。要實現(xiàn)高通量、大規(guī)模的檢測，有望借助生物芯片這項技術(shù)。生物芯片正逐步應(yīng)用于細菌及病毒的檢測，它不僅能克服 PCR 擴增技術(shù)中難題，對 PCR 擴增技術(shù)還能起到補充作用［19］。目前人們針對病毒，甚至 AIV 檢測芯片不斷優(yōu)化雜交條件；將核酸擴增產(chǎn)物片段化，以減少核酸二、三級結(jié)構(gòu)效應(yīng)對雜交的影響；以及對芯片載體結(jié)構(gòu)和檢測方法進行改進，都為建立快速、靈敏、特異的 AIV 檢測方法提供平臺［21］。
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第8篇：核酸檢測方法范文
【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜法；氨茶堿；鹽酸麻黃堿
復(fù)方氨茶堿口服液是以氨茶堿和鹽酸麻黃堿為主要成分的復(fù)方制劑，用于治療小兒喘息性支氣管炎。2005版藥典用紫外分光光度法測定氨茶堿含量［1］，用非水滴定法和紫外分光光度法測定鹽酸麻黃堿含量［2］。已有文獻報道氨茶堿和鹽酸麻黃堿的高效液相色譜含量測定方法［35］，但同時測定兩者含量的方法還未見報道。本文采用高效液相色譜法同時測定氨茶堿和鹽酸麻黃堿的含量，該法簡單、靈敏、準確。
1 儀器與試劑
Agilent 1100系列高效液相色譜儀，包括手動進樣器、單元泵、二極管陣列檢測器。Jasco V500 UV/Vis分光光度計，MTTLER TOLEDO AL104電子天平，MTTLER TOLEDO 320 pH計。
氨茶堿和鹽酸麻黃堿對照品（浙江省藥品檢驗所），復(fù)方氨茶堿口服液（批準文號：浙藥制20050201，浙江大學附屬兒童醫(yī)院制劑室自制，批號：20060330，20060807，20061123）。乙腈為色譜純（TEDIA公司），磷酸二氫鉀為分析純（上海試劑二廠）。水為超純水，電阻率≥18.2 MΩ·cm。
2 方法
2.1 色譜條件
色譜柱：Agilent Zorbax SBC18 (250 mm × 4.6 mm，
5 μm)；流動相：乙腈磷酸二氫鉀緩沖液(pH 4.5)（10∶90，V/V）；檢測波長：214 nm；流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：室溫。
2.2 對照品溶液的配制
精密稱取氨茶堿對照品100 mg和鹽酸麻黃堿對照品10 mg，分別置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得濃度為1 mg/mL和0.10 mg/mL的儲備液，備用。
2.3 樣品溶液的配制
精密量取復(fù)方氨茶堿口服液10 mL，置于50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。用0.45 μm微孔濾膜過濾。精密量取續(xù)濾液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。
3 結(jié)果
3.1 色譜圖
氨茶堿和鹽酸麻黃堿的檢測限分別為10、30 ng/mL（S/N=3）， 定量限分別為30、100 ng/mL（S/N=10），保留時間為9.4 min、11.4 min，氨茶堿和鹽酸麻黃堿分離度R=4.8，理論塔板數(shù)均大于8 000，符合測定要求，輔料對氨茶堿和鹽酸麻黃堿均無干擾，色譜圖見圖1。
3.2 標準曲線制備
精密移取上述對照品儲備液各0.2、0.5、1.0、2.0、
5.0 mL置于10 mL容量瓶中，混合、加水稀釋至刻度，搖勻，即得氨茶堿和鹽酸麻黃堿濃度分別為20.0、50.0、100.0、200.0、500.0 μg/mL和2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的混合溶液，按上述色譜條件進樣。以峰面積A對藥物濃度C（μg/mL）進行線性回歸，求得氨茶堿的標準曲線（n=5）為：A=76.85C104.530，r=0.9999， 氨茶堿在20.0～500.0 μg/mL濃度范圍呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；鹽酸麻黃堿的標準曲線（n=5）為：A=38.71C8.203，r=0.9999，鹽酸麻黃堿在2.0～50.0 μg/mL濃度范圍呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。
3.3 精密度試驗
精密量取對照品儲備液分別配制成含氨茶堿和鹽酸麻黃堿濃度為20.0、100.0、500.0 μg/mL和2.0、10.0、50.0 μg/mL對照品溶液，一天內(nèi)連續(xù)進樣5次，計算日內(nèi)精密度，氨茶堿和鹽酸麻黃堿的RSD在高、中、低三個濃度分別為0.68%、0.71%、1.06%和0.70%、
1.28%、1.66%，符合精密度要求。
3.4 穩(wěn)定性試驗
按“2.3”項配制樣品溶液，間隔24 h、48 h、72 h在相同的實驗條件下進樣，氨茶堿和鹽酸麻黃堿的峰面積基本沒有變化（氨茶堿RSD
3.5 回收率試驗
按復(fù)方氨茶堿口服液處方配制不含主藥的空白溶液，精密稱取一定量的氨茶堿和鹽酸麻黃堿對照品，制成高、中、低三種濃度溶液（分別相當于標示量的120%、100%、80%）。按“2.3”項下方法處理，按“2.1”項下方法分別測定，代入標準曲線，所得結(jié)果與加入量比較得氨茶堿和鹽酸麻黃堿的平均回收率分別為99.7%、100.1%，RSD分別為0.58%（n=9）、1.31%(n=9)。
3.6 樣品測定
按上述色譜條件進樣20 μL，記錄色譜峰面積，代入標準曲線，計算，結(jié)果見表1。表1 樣品含量測定結(jié)果（略）
4 討論
通過紫外掃描氨茶堿和鹽酸麻黃堿的水溶液(見圖2)發(fā)現(xiàn)，氨茶堿的最大吸收波長在275 nm附近，在214 nm處的吸收也很強，而鹽酸麻黃堿在275 nm波長附近處吸收很弱，在214 nm附近吸收較強。因此，本文選用214 nm作為同時測定兩者含量的檢測波長，可以獲得較高的靈敏度。流動相選用乙腈磷酸二氫鉀緩沖液(pH 4.5)（10∶90， V/V）使兩組分的分離效果更好，有利于含量測定。
本法快速、靈敏、準確，能同時測定氨茶堿和鹽酸麻黃堿的含量，可用于復(fù)方氨茶堿口服液的質(zhì)量控制。
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第9篇：核酸檢測方法范文
[關(guān)鍵詞] 沙眼衣原體；SAT； PCR；培養(yǎng)；尿液
[中圖分類號] R374.1 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2011）22-124-02
Real-time Fluorescence Detection of Nucleic Acid Amplification Constant Urine Analysis of Chlamydia Trachomatis
SUN Yuhua CHEN Feng CAI Ruiyun
Guangji Hospital in Dongguan City of Guangdong Province，Dongguan 523690，China
[Abstract] Objective To evaluate the real-time isothermal nucleic acid amplification fluorescence（SAT） Chlamydia trachomatis in urine（CT） of the specificity and sensitivity. Methods 175 cases of suspected patients of genital swab line CT-SAT，PCR testing and Chlamydia trachomatis culture，while the corresponding urine specimens of 175 CT-SAT test. Results SAT on the same source swab specimens and urine samples consistent results：Case of SAT-positive and N.gonorrhoeae culture-negative，2 SAT-negative and PCR positive. Conclusion SAT swabs and urine detection of Chlamydia trachomatis with high sensitivity and specificity of laboratory diagnosis for the CT to provide a new detection method.
[Key words] Chlamydia trachomatis； SAT； PCR； Culture；Urine
實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)（simultaneous amplification and testing，SAT）是將新一代的核酸恒溫擴增技術(shù)和實時熒光檢測技術(shù)相結(jié)合的一種新型核酸檢測技術(shù)，該技術(shù)具有高靈敏度、高特異性、低污染、反應(yīng)穩(wěn)定等優(yōu)點。
1 材料與方法
1.1 主要儀器及試劑
CT-SAT試劑盒由上海仁度生物科技有限公司提供，PCR試劑盒由深圳匹基生物工程有限公司提供，沙眼衣原體培養(yǎng)使用Mc Coy培養(yǎng)皿，實時熒光核酸擴增儀為杭州博日科技有限公司生產(chǎn)。
1.2 標本來源
2009年9月～2010年7月來本院就診的疑似患者175例，其中男62例，女113例，每份患者取3份分泌物拭子標本和1份尿液標本。
1.3 標本采集
準備3個無菌拭子，分別以A、B、C標示。B號拭子的管內(nèi)加入1mL無菌生理鹽水，C號拭子的管內(nèi)加入1.5mL無菌生理鹽水。患者采樣前2h不排尿，取材方法按常規(guī)操作[1]。即男性患者由尿道口內(nèi)3cm處、女性患者由宮頸口內(nèi)1～1.5cm處取材。棉拭插至取材處后，轉(zhuǎn)動并停留數(shù)秒種后取出。A拭子用于淋球菌培養(yǎng)，1h內(nèi)盡快接種。B拭子取后-20℃冰箱保存，作PCR測定待用。C拭子取后取1mL混合液至專用尿液保存液（試劑盒提供）中，混勻，-20℃冰箱保存，作CT- SAT測定待用。另取1mL首段尿液至專用尿液保存液（試劑盒提供）中混勻，-20℃冰箱保存，用于CT-SAT測定待用。
1.4 檢測方法
尿液標本和拭子標本從冰箱取出，平衡至室溫同時行CT-SAT檢測，按照試劑盒說明書進行操作。
1.5 沙眼衣原體培養(yǎng)
見參考文獻[1]。
1.6 統(tǒng)計學分析
應(yīng)用SPSS10.0軟件對數(shù)據(jù)進行χ2檢驗。
2 結(jié)果
2.1 SAT、PCR及沙眼衣原體培養(yǎng)的檢測
SAT檢測的陽性63例尿液標本其對應(yīng)的63例拭子標本SAT檢測也是陽性，符合率100%，1例沙眼衣原體培養(yǎng)陰性而SAT陽性，2例PCR陽性而SAT陰性。尿液標本不適用于PCR和沙眼衣原體培養(yǎng)，故均以拭子結(jié)果為參照[4]。見表1。
2.2 CT-SAT檢測的敏感性及特異性
與沙眼衣原體培養(yǎng)結(jié)果作比較，CT-SAT尿液/拭子標本的檢測靈敏度為98.41%（62/63），特異性為99.11%（112/113），經(jīng)χ2檢驗，差異無顯著性（χ2=0.01，P＞0.05）；與PCR結(jié)果作對比，CT-SAT尿液/拭子標本的檢測靈敏度為100%（63/63），特異性為98.21%（110/112），經(jīng)χ2檢驗，差異無顯著性（χ2=0.05，P＞0.05）。見表1。
2.3 CT-SAT法對拭子標本和尿液標本檢測結(jié)果的符合率分析
CT-SAT法對175例患者的拭子標本和尿液標本進行檢測，兩組標本檢測結(jié)果的符合率為100%，差異無顯著性（P＞0.05）。
3 討論
目前CT檢測都是以患者的泌尿生殖道分泌物進行沙眼衣原體抗原檢測、沙眼衣原體培養(yǎng)和/或PCR檢測。取生殖道分泌物容易增加患者的取樣痛苦，同時幾種檢測方法在敏感性和特異性上都有不足。沙眼衣原體抗原檢測多用膠體金試劑，陽性率都較低容易造成女性患者尿道感染的漏檢。沙眼衣原體培養(yǎng)的敏感性和特異性都較好，但是耗時長。PCR檢測的是DNA，患者治療后病灶處殘留的DNA包括殺死后還沒排出的菌體DNA都會導(dǎo)致PCR陽性結(jié)果。病人經(jīng)治療后病菌死亡、癥狀消失即可判為治愈，如果要等PCR轉(zhuǎn)陰，勢必造成過度治療[2]。本研究中有2例PCR陽性而CT-SAT及沙眼衣原體培養(yǎng)均陰性就是這種情況。CT-SAT檢測病原菌體RNA，RNA在死亡的病原體中快速降解，活菌中才有完整的RN段，故能排除患者治療后病灶處的殘留物對檢測結(jié)果的影響，有利于臨床用藥后的療效監(jiān)測及判愈。在175例標本中1例CT-SAT陽性，而沙眼衣原體培養(yǎng)陰性，可能是沙眼衣原體培養(yǎng)敏感性不足的原因，此例標本經(jīng)PCR實驗后得到驗證，也證明了CT-SAT的高靈敏度。而且CT-SAT可以對尿液標本進行檢測，尿液作為一種非侵入性的取樣標本，取樣方便，減少了患者采樣的痛苦，也減少了醫(yī)生的工作量[3]。RNA在環(huán)境中極不穩(wěn)定，容易降解，大大降低了交叉污染概率及環(huán)境污染[4]。
本研究顯示，利用SAT技術(shù)檢測沙眼衣原體，不僅特異性好，靈敏度高，可用于臨床用藥后的療效監(jiān)測及判愈，而且尿液標本可以代替拭子標本。在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出采樣方便、耗時短、低污染、結(jié)果準確可靠等優(yōu)點，為沙眼衣原體的實驗室診斷提供新的采樣方式和檢測方法[5]，是一種值得推廣的檢測方法。
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