生物醫(yī)學多光譜成像應用

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1引言

研究生物體內復雜的生物過程，最直觀的方法就是成像技術，如免疫組化、熒光原位雜交技術、細胞成像技術以及活體動物體內成像技術等。由于自發(fā)熒光以及光譜重疊的干擾，這些成像方法都只能用一種染料標記特定分子進行成像，即便通過熒光共振能量轉移來研究分子間的相互作用，也只能同時有兩種染料標記，且無法消除光譜重疊的干擾。生物體內過程的復雜性決定了單色成像用于生物醫(yī)學研究的局限性，特別是人類基因組計劃完成后，研究進入后基因組時代，更加注重基因表達和蛋白質功能信號通路的研究，這些核酸和蛋白質復雜多樣，在體內行使著多種多樣的功能，傳統(tǒng)的單色標記成像已遠不能滿足研究需求，而多光譜成像（multispectralimaging,MSI）技術，可以去除光譜重疊的干擾，同時標記多個生物分子，對生物體內復雜的物質代謝、信號轉導等生物過程能進行實時監(jiān)測。近年來，隨著成像學和光譜學的發(fā)展，使得圖像被解混（unmixed）成為可能，多種染料標記不同的生物分子，即使存在非常明顯的光譜重疊，通過光譜解混也能將每種光學信號彼此分離開來，MSI技術應運而生。本文就MSI技術的基本原理及其在生物醫(yī)學方面的應用進展做一綜述。

2MSI的基本原理

MSI技術是基于成像學和光譜學發(fā)展起來的一門新興技術[1]，它作為一種分析工具，可應用于包括生物醫(yī)學在內的很多不同的研究領域。多種熒光同時標記時，經(jīng)過單色光的激發(fā)，其多種熒光信號混雜在一起，通過液晶可調諧濾光片（liquidcrys-taltunablefilter,LCTF）對所需波長光進行濾過和電荷藕合元件（chargecoupleddevice,CCD）相機的采集，然后經(jīng)信號解混系統(tǒng)將采集到的多種混雜的光解混，經(jīng)過信號輸出和顯示，可直觀地觀察到不同顏色標記的生物樣品的不同的成分或定位。MSI技術和普通成像技術的最大不同之處，能獲得每張圖像每個像素點的高分辨率的光譜，而不是肉眼所見的紅、藍、綠三色圖像。目前獲得光譜的方式主要可通過LCTF技術，LCTF是由一組連續(xù)的濾光片組成，它可以和CCD相機等設備很好地配合用于成像。LCTF通過對濾光片的連續(xù)調節(jié)，可允許很窄（10-20nm）帶通的光線通過相機，很快獲取不同波長的光譜數(shù)據(jù)，建立一個三維的“cube”。在這個“cube”里，每種光譜對應每個像素點，然后在不同波長處檢測熒光探針或染料在細胞或組織中的分布，快速和精確地進行光譜分類和分離，去除樣本的自發(fā)熒光，從而顯著地改善成像過程，并且同時適合于明視野和熒光的多靶點成像，具備完美的共定位分析功能而且通過計算純光譜方法學（computepurespectrum,CPS）定量更加準確[2,3]。目前應用較為廣泛的成像系統(tǒng)是美國劍橋CRi公司開發(fā)的MSI系統(tǒng)，該系統(tǒng)的結構示意圖及產(chǎn)品。除了多光譜活體成像系統(tǒng)外，將多光譜成像原理和流式細胞術聯(lián)合使用而開發(fā)出的ImageStream系統(tǒng)也引起廣泛關注。該系統(tǒng)整合了流式細胞術和熒光顯微技術，結合現(xiàn)代方法學進行成像分析，和流式細胞術相比，該系統(tǒng)可以基于熒光信號同時分析大量細胞的生物學特征并進行數(shù)據(jù)分析，還提供了形態(tài)學數(shù)據(jù)[4]，如利用該系統(tǒng)可進行細胞凋亡的檢測[5]。

3MSI成像特點

組織的自發(fā)熒光限制了熒光染料在體內成像的應用，MSI技術的出現(xiàn)使得這一問題迎刃而解。在活體動物中，動物胃腸內容物、皮膚等均有很強的熒光信號，特別是當激發(fā)光為藍色或是綠色時尤為明顯，通過利用近紅外發(fā)射波長的熒光染料，可以減少光的散射，吸收自發(fā)熒光，但自發(fā)熒光仍然限制著成像的靈敏度，成像依然不理想。而通過MSI，可以消除自發(fā)熒光的影響[6]，使得其在多熒光標記和混合標記方面有很好的應用。MSI技術可以適用于各種染料如傳統(tǒng)的熒光染料，明視野下的蘇木精、二氨基聯(lián)苯胺等。傳統(tǒng)的熒光染料如熒光蛋白，可以很好地用于MSI技術，熒光蛋白作為一種信號報告分子，它們可以示蹤細胞位移和亞細胞的生物過程，如基因表達和信號轉導等[7]。近年來發(fā)展起來的新型熒光探針如量子點（quantumdots,QDs），以其良好的光學特性，尤其適用于MSI系統(tǒng)。QDs具有激發(fā)光譜寬而連續(xù)、發(fā)射光譜窄而對稱、熒光強度高是羅丹明6G的20倍、光化學穩(wěn)定性好是羅丹明6G的100倍以上、耐光漂白、發(fā)射光顏色與粒徑大小關聯(lián)等優(yōu)點，故選用粒徑大小不同的量子點，在同一激發(fā)波長下，不同的量子點將會呈現(xiàn)不同的顏色，通過CCD相機捕捉，便可很理想地用于多光譜熒光分子成像[8]。

4生物醫(yī)學的應用

MSI技術的最新進展已使實時表征、生物功能評定和手術中引導成為可能，包括在基礎研究和臨床應用等相關方面。

4.1基礎研究

生物體內蛋白種類繁多，且相互間作用關系復雜，MSI技術為我們提供了一種高效直觀的研究方法，該技術可以對生物組織內的發(fā)色團的空間分布進行成像[9]，也可以同時進行多種蛋白的體外成像研究，利用多種不同量子點標記不同的蛋白用于蛋白印跡，具有更高的亮度和穩(wěn)定性[10]。本課題組最近利用MSI結合量子點免疫熒光技術檢測了肺癌組織中EMMPRIN和p53蛋白的共表達，乳腺癌組織內Her-2和CK蛋白的共表達，結果表明：不論蛋白定位是否相同，解混后均能得到每個蛋白的表達信號，還可去除組織的自發(fā)熒光，提高了圖像的信噪比[11,12]。利用傳統(tǒng)熒光標記，在同一激發(fā)波長下，MSI可以同時檢測福爾馬林固定石蠟包埋組織中三種不同的蛋白，不管是否有共定位，表明這種成像方法有利于在組織和細胞中完成多重分析[13]。除了單純的蛋白成像，MSI技術還能用于研究蛋白分子的折疊和結合過程[14]，進一步拓寬了其應用范圍。

4.2臨床應用

多種成像技術已廣泛地在臨床上用于疾病的診斷，如核磁共振成像（MRI）、計算機體層攝影術（CT）、正電子發(fā)射體層攝影（PET）等，但這些成像系統(tǒng)價格昂貴，相比之下，MSI系統(tǒng)則更占優(yōu)勢，而且可以提高靈敏度和精確度，同時進行多色標記等，在疾病的診斷方面具有廣闊的應用前景。研究者們開發(fā)了一種內窺鏡偏振光掃描光譜學（endoscopicpolarizedscanningspectroscopy,EPSS）系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)對整個食管表面的快速光譜掃描和多光譜成像，可以近實時地提供診斷[15]。EPSS通過掃描和成像可疑位點，指導組織活檢如癌前病變、非典型增生等是可行的?？偨Y已發(fā)表的文獻，發(fā)現(xiàn)皮膚相關疾病和腫瘤的多光譜成像相關研究較為深入，本文主要從這兩方面來介紹該技術的應用。

4.2.1皮膚疾病應用研究

MSI技術由于其光譜穿透能力的限制，對深層組織的成像效果往往不佳，但對淺層組織特別是皮膚，其成像效果很理想，并可以通過人皮膚不同層次的斷面掃描，重建三維立體模型，且不受皮膚色素的影響[16]。2010年，Jakovels等[17]利用MSI技術在500-700nm光譜區(qū)間和500-600nm及530-620nm兩個子區(qū)間內同時測定了皮膚的三個發(fā)色團（chromophores）：氧合血紅蛋白、去氧血紅蛋白和黑色素，由于這三個發(fā)色團的吸收光譜不同，故該技術可以明顯區(qū)分這三者。皮膚黑色素瘤的早期檢測對患者的生存至關重要，新形成的腫瘤的特點之一就是病變部位的血流量增加。實驗證明500-700nm范圍內的MSI成像具有高靈敏度和更高的反應穩(wěn)定性，并得到了臨床試驗的證實，基于該原理，也可以測定皮膚病變血管中氧合血紅蛋白和去氧血紅蛋白的含量，來評估皮膚血管的血氧飽和度并估計血流量，從而有助于黑色素瘤的早期診斷[18]。MSI系統(tǒng)還可以與人工神經(jīng)網(wǎng)絡方法進行整合獲得重構的高光譜cube，用于皮膚病變的體內成像，結果表明高光譜cube可提供皮膚光反射的光譜數(shù)據(jù)以及二維空間信息，這有助于改善從皮膚癌到炎癥疾病的診斷和隨訪[19]。皮膚損傷是全球很普遍和治療成本較高的疾病，并且其病因和愈合過程具有多因素性和復雜性。由于測量傷口大小和其他相關特征具有主觀性，創(chuàng)傷愈合的定量評價難以開展，而利用MSI技術可以很好地解決這一問題[20]。Basiri等[20]人設計了一種新型的多光譜相機，這種相機可以在單一的快照中獲得18種不同波長的圖像，通過相機與濾鏡的有機結合，將這一技術應用于皮膚發(fā)色團的表征。為了評價皮膚的細胞外基質的生物工程成分———聚羧甲基葡萄糖酸鹽（polycarboxymethylglu-cosesulfate,PCMGS）在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中是否有促進作用，他們利用MSI技術來量化皮膚氧飽和度及其和傷口愈合之間的關系，結果顯示，隨著時間的推移，傷口大小均逐漸減小，O2含量逐漸下降，證明O2在創(chuàng)傷愈合過程中起著重要作用。

4.2.2腫瘤應用研究

腫瘤現(xiàn)已成為世界范圍內的公共衛(wèi)生問題，且其發(fā)病率和死亡率一直呈上升趨勢。應用成像技術進行腫瘤的發(fā)生、生長、侵襲和轉移等研究具有直觀便捷等優(yōu)點，但由于腫瘤生物學過程的復雜性，單色成像遠遠不能滿足腫瘤研究的需求。MSI技術出現(xiàn)后，在腫瘤診斷和治療中的應用更為廣泛。Song等[21]第一次用單抗偶聯(lián)的熒光磁性靶向多功能納米生物探針進行多種細胞的檢測和分離。利用這種MSI成像技術，他們成功地從多種混合細胞中檢測和分離出了白血病細胞和前列腺細胞，并且這種分離效果可以達到96%以上。應用這項技術結合特異性單抗，可以進行腫瘤的早期診斷，這種方法不但簡單、敏感、有效、快速并且成本低。在臨床上，這種非侵襲性的MSI技術是一種很好的方法，可以用于腫瘤如前列腺癌的活檢、放療、外科手術定位及對腫瘤的病程監(jiān)測，以彌補單色成像的不足[22]。Gilbert等[23]應用MSI在膀胱小塊活檢組織中同時檢測CK20和p53蛋白的共表達，根據(jù)蛋白表達水平，可區(qū)分腫瘤性尿路上皮、良性或反應性尿路上皮。Roblyer等[24]利用多光譜寬視野光學成像可早期檢測口腔腫瘤，該技術可以精確鑒別腫瘤組織和非腫瘤組織，但其不能區(qū)分癌前病變和癌組織。在腫瘤局部區(qū)域治療中，精確的腫瘤切除是很重要的。手術中采用多光譜熒光成像結合傳統(tǒng)的成像方法如x-線、MRI、SPECT/CT和超聲有利于腫瘤切緣的精確決定[25]。Noonan等[26]將MSI系統(tǒng)和關節(jié)機器人內窺鏡聯(lián)合用于腫瘤細胞的邊緣鑒定和定位，這將使腫瘤的定位更準確，極大地有利于腫瘤手術切除，特別是那些難以診斷和定位的腫瘤。Chin等[8]報道應用基于雙發(fā)射量子點的多光譜術中熒光實時成像可指導外科手術的切除。前哨淋巴結（sentinellymphnode,SLN）是腫瘤轉移時最先受累的一個或一組淋巴結。在腫瘤的轉移過程中，如果SLN內無腫瘤細胞轉移，則下游淋巴結也不會有轉移，故SLN內腫瘤細胞的存在與否可以證明腫瘤是否通過淋巴道轉移，MSI技術也廣泛應用于該領域研究。Crane等[27]在10個早期子宮頸癌病人手術過程中將專利藍和吲哚菁綠混合物注入子宮頸內，然后通過多光譜熒光攝像系統(tǒng)進行實時記錄，6個病人淋巴道檢測到了熒光信號，共檢測了9個SLNs，其中一個有腫瘤轉移。這表明將MSI用于檢測子宮頸癌的SLN轉移是可行的，但考慮到靈敏度和特異性，這種方法需要進一步改進。同年他們小組還用相同的方法成功地對陰道和卵巢癌的SLN進行成像[28]。與傳統(tǒng)技術相比，這種技術可以實時監(jiān)測熒光信號，將其用于指導手術，不需要使用放射性膠體，可保護病人隱私減輕病人心里痛苦。

4.3其它應用

MSI系統(tǒng)以其優(yōu)良性能為科研工作者帶來了極大地便利。到目前為止，除了皮膚和腫瘤相關研究，該技術也廣泛應用于生物醫(yī)學的其它各個方面。Rouse等[29]在白天光照條件下利用實時監(jiān)測成像系統(tǒng)檢測植被反射時CO2進入大氣的含量。Weber等[30]將CT成像和多頻空間頻率域成像（SFDI）聯(lián)用進行MSI檢測小鼠腦損傷，提高了圖像獲取性能。Hight等[31]用多光譜熒光成像系統(tǒng)進行細胞外pH測定，并評價了該系統(tǒng)用于結直腸癌細胞異體移植的高分辨率pH測定的可行性進行了評價。Kulesa等[32]利用多光譜指紋印跡技術，通過多色細胞標記和多光譜共聚焦成像方法對位置隨時間不斷變化的胚胎細胞進行了實時跟蹤，解決了胚胎細胞示蹤困難的問題。Luckl等[33]通過MSI監(jiān)測局部腦缺血來闡明對側前爪刺激產(chǎn)生的神經(jīng)保護效應的可能機制。除此之外，近三年來，隨著該技術的不斷發(fā)展成熟，這項技術在生物醫(yī)學領域的方方面面都得到了廣泛地應用，如視網(wǎng)膜成像[34]，Tourette綜合癥中大腦形態(tài)測量[35]，嗜酸性食管炎的定位[36]，大腦毛細血管內皮細胞的成像[37]等。雖然MSI技術應用日趨廣泛，不得不注意到的是由于熒光散射和吸收導致的其熒光信號的低穿透能力，這也是其廣泛應用于皮膚相關研究而較少用于體內深部組織研究的原因，即便是應用性能優(yōu)良的新型染料如量子點，也只能穿透十幾毫米而已[8]，因此研究者們渴望開發(fā)出熒光強度更高性能更好的熒光染料。

5結語和展望

近年來，MSI技術在生物醫(yī)學領域的應用已日趨廣泛和深入，大大地推動了生物醫(yī)學的發(fā)展，特別是在改進疾病檢測或鑒別和術內轉移診斷的精確性，指導神經(jīng)外科并能監(jiān)控治療反應等方面的應用[38]。MSI技術以直觀的方式展現(xiàn)了生物體內的復雜過程，雖也有些不足之處，但也難以掩蓋它與其它成像技術相比的獨特優(yōu)越性，隨著新型熒光染料如量子點的不斷發(fā)展，其在生物醫(yī)學領域的研究和應用也必將更加廣泛！